合工大版生化实验方案.docx

植物不同组织可溶性蛋白提取和多肽组分差异研究实验目的：本实验通过对植物不同组织可溶性蛋白的提取，含量测定，差异条带研究，从而掌握蛋白质的系列研究方法和操作实验原理：蛋白质的性质、结构和功能的研究，以及生物体内蛋白质构象的变化都是建立在蛋白质分离纯化基础上的。在蛋白质的分离过程中，必须通过分子量大小测定来获得所提蛋白质的大小，并通过SDS电泳比较分析有差异的条带。考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。实验仪器：研钵、离心机、紫外分光光度计、试管、量筒、烧杯、试剂瓶、冰箱、1000ml容量瓶250ml容量瓶、天平等。实验药品：基本：pH试纸、、B-巯基乙醇、Tris、考马斯亮蓝G-250(500mg)（称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml）、30%Acr(36.5ml)、1%Bis(28ml)、液氮、90%乙醇(250ml)、磷酸（85%，W/V）(500ml)、牛血清白蛋白（配成1000μg/ml和100μg/ml）1%TEMED(10ml)、分离胶缓冲贮备液、浓缩胶缓冲贮备液、电极缓冲液、样品溶解缓冲液、固定液、染色液、脱色液（一）：PVP聚乙烯吡咯烷酮(30g)、甘油(375ml)、1Mtris-HCl(PH8)（225ml）（二）：10%TCA、0.07%的β-巯基乙醇的丙酮、2.7g尿素、0.2gCHAPS、、灭菌的往离子水、1M的DTT65ul/ml（三）：尿素、碳酸钾，1.25%SDS、0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)、6%TritonX-100本次实验用（一）操作过程：提取与分离：称取一定量材料→用组织捣碎机捣碎→提取→二次抽提一、植物组织蛋白质提取方法1）、根据样品重量(1g样品加进3.5ml提取液，可根据材料不同适当加进)，预备提取液放在冰上。2）、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加进提取液中在冰上静置(3-4小时)。　3）、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃　4）、提取上清液，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml1）、1Mtris-HCl(PH8)45ml2)、甘油(Glycerol)75ml3)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g(这种方法针对SDS，垂直板电泳！)二、植物组织蛋白质提取方法　　　　氯醋酸—丙酮沉淀法　　1、在液氮中研磨叶片　　2、加进样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。　　3、加进等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。　　4、上样前加进裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。　　5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放进-80℃备用。　　药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的往离子水中(终体积为5ml)，使用前再加进1M的DTT65ul/ml。　　（这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！）三、蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。100mg材料剪碎后加进10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加进1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。　　按每mg干粉加进20μl(可调)UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Amphol