直接法抗原＋酶标Ⅰ抗特异性抗体.PPTVIP

* 免疫组织化学的原理及其应用 中南大学基础医学院病理学教研室 免疫组化技术的原理 利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特异性抗原和抗体进行定位、定性或定量检测的一门技术。 免疫组化的发展史 1941年，Coons 免疫荧光技术 1968年，Nakane(中根一惠) 酶标记技术 1974年，Sternberger PAP技术 1975年，Kohler 和Milstein 单克隆抗体技术 1981年，Hsu(许世明) ABC法 1990年代--现在， SP法，原位杂交，原位PCR 免疫荧光组织(细胞)化学 免疫荧光组织(细胞)化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。 在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量 免疫荧光技术的不足 需要荧光显微镜 荧光衰减,不能长期保存 定位不准确 免疫组化的优点 特异性强 敏感性高 定位准确、形态与功能相结合 免疫组化主要染色方法的原理 主要的技术:免疫荧光技术 免疫金银标记技术 免疫酶标记技术(PAP法) 亲和免疫组化技术(ABC法, SP法) 一、直接法 抗原 ＋酶标Ⅰ抗（特异性抗体）＋底物 用于标记的酶应具备以下几点 ① 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易 于光镜或电镜下观察 ② 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向 周围组织弥散，影响组织学定位 ③ 较易获得的酶分子，最好有商品出售 ④ 中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变， ⑤ 酶标过程中，酶与体连结，不能影响二者的活性 ⑥ 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质 辣根过氧化物酶 （Horseradish peroxidase , HRP） 是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根 （西洋山嵛菜）的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的 酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占 16%～18（8条糖链分布在HRP分子表面），分子量40kD ， 最适pH5～5.5，最适温度40～45℃； pH4～11，50℃ 以下均较稳定，易溶于水和58%以下 的饱和硫酸铵溶液。 免疫细胞化学常用的酶 有 － 160～190kD Glucose oxidase 有 +++ 100Kd Acid phosphatase 有 ++ 80～120Kd Alkaline phosphatase 有 + 40～45KD Horseradish peroxidase 商 品 内 源 性 分 子 量 名 称 显色反应(底物) HRP 的底物 DAB (3，3-二氨联苯胺) 棕黄色 4-氯-1-萘酚 灰兰色 α-笨脂派若宁 红色 ALP 是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色 GOD 是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀 直接法的优点: 方法简单,特异性高。 直接法的缺点: 每一种特异性抗体都需要标记, 敏感性相对较低.