肢体功能训练对脑梗死后大鼠脑内不同部位内源性神经干细胞增殖、迁移及分化的影响及机制研究实验设计.ppt

立题依据 中枢神经系统高度的可塑性 脑卒中后NSC的增殖、迁移及分化 海马齿状回 室管膜下区 纹状体 大脑皮质 康复训练与NSCs 立题依据 NSCs增殖、迁移及分化的指标 巢蛋白（Nestin） ——未成熟神经干细胞的标志物 4，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)阳性标志物 ——标记有增殖活性的细胞 立题依据 NSCs增殖、迁移及分化的调控指标 神经可塑性蛋白： GFAP——星型胶质细胞的标志蛋白 MAP2——存在于神经元的树突中 SYN——突触前膜特异性标志 GAP43——存在于神经元的轴突中 立题依据 细胞外基质（ECM）中糖蛋白调控 神经粘蛋白(neurocan) reelin蛋白 立题依据 基因调控 Notchl——控制细胞命运的信号传导途径 bHLH基因转录调控因子——调控基因转录 Hes5信号通路——抑制NSCs分化促进NSCS增殖 Mashl——促进干细胞的分化 核转录因子-κB——炎症和免疫反应的调控基因 研究目标 患侧、双侧功能训练治疗后—— 行为学测试——不同功能训练的效果 脑内不同区域内源性NSCs的增殖、迁徙和分化的情况—— 对内源性NSC的激活时机、激活条件以及定向控制进行初步的探讨 研究梗死灶周围脑组织建立纤维联系，并部分重建神经功能网络的情况。 研究内容 对Wistar大鼠（成年雄性，270-300g）进行大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的建立。 不同的功能训练治疗及行为学测试 常规病理检查和免疫组织化学 -HE染色 -NSCs的检测 -BrdU标记及大鼠脑组织的获取 -免疫组化法检测BrdU+细胞(原位干细胞的增殖) -双标化法检测BrdU+／NeuN+细胞数 -双标化法检测PqBrdU+／GFAP+或DCX+细胞数的变化。 -细胞计数 -免疫组织化学检测nestin、GFAP和MAP2 -双重免疫组织化学检测nestin和GFAP 研究内容 原位杂交检测nestin和neurocan Western blotting检测nestin、GAP43、SYN、GFAP、MAP2、NCAM、neumcan和reelin 图像分析和定量 -脑梗死灶相对体积计算 -Brdu阳性细胞数 -nestin、GFAP和MAP2免疫组化阳性强度计算 -蛋白表达量 采用RT-PCR和Western blotting检测MCAO大鼠不同康复训练的Notch1、Hes5和Mash1 mRNA及蛋白的表达，采用RT-PCR和免疫组化技术检测N-κB p65 mRNA及蛋白的表达。 拟解决的关键问题 不同的康复训练达到不同的效果，本试验为临床的康复模式的改良提供理论及试验基础。 局灶性脑缺血损伤后，康复训练可以影响内源性神经干细胞。目前机制未明。本试验拟在探讨不同形式的康复训练对神经干细胞的增殖、迁移和分化影响及发生机制。 可行性分析 国内外目前对康复的机制研究都有大量的报道，同时对什么方式进行康复有着较大的争议，本人在硕士课题研究期间已经初步证实，对脑梗死大鼠进行双侧电刺激无论在行为学测试中，还是脑内梗死灶周围的血管网密度及放射性计数指标上，均优于患侧电刺激。本课题旨在研究双侧康复训练及患肢康复训练对内源性神经干细胞的增殖迁移和分化的影响、发生机制及行为学测试结果进行进一步的探讨及证实。 本校的实验动物部及附属一院的中心实验室拥有完成本项目的所有设备及条件。 立题创新之处 双侧康复训练与以往重视患侧康复训练的模式不同，它是康复领域中一种全新的模式。 目前很多研究倾向于外源性神经干细胞。本试验旨在进行内源性神经干细胞的研究，能充分避免外源性干细胞迁移分化控制不精确、取材不易、靶点注射困难、排斥反应、伦理和安全性等很多弊病。激活内源性NSCs，促其向梗死灶迁徙、分化为神经元，以建立充分的突触联系和有功能神经网络，这是更有临床意义的研究方向。 实验进程 2009年3月—2009年9月 文献检索、立题、 文献综述、 实验设计 2009年9月—2010年6月 预实验、开题报 告阶段 2010年7月—2010年12月 正式实验阶段 2011年1月—2011年4月 论文书写、修 改及投稿阶