(精选)【医学课件课件】1991年诺贝尔生理医学奖-膜片钳技术教学课件.pptVIP

1991年诺贝尔生理医学奖 膜片钳技术 主讲人：唐国奎 Neher出生于1944年，德国人1965年毕业于Wisconsin University1976年在耶鲁大学医学院取得医学博士学位此后长期从事基础医学研究 获奖者简介 Sakmann1942年出生于德国的斯图加特市1963年毕业于Tubingen 大学，一直从事电生理学方面的研究 1976年Neher和Sakmann合作发明了patch clamp技术，发现了细胞膜存在离子通道，而共同获得1991年诺贝尔奖。 1976年Neher和Sakmann建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。以后由于吉欧姆阻抗封接（109Ω）方法的确立和几种方法的创建，1980年以来，此技术已可用于很多细胞系的研究。 前言 膜片钳技术的优势在于其具有0.06pA的电流测量灵敏度，1μm2的空间分辨率及10μS的时间分辨率。使我们通过该技术了解到某个瞬间、特定条件，细胞膜离子通透性和膜通道蛋白构型的变化，从而使其成为目前从功能角度探讨各种生理、病理功能机制的最直接、理想的电生理学研究手段。该技术的问世，为生理学、药理学、病理生理学和分子生物学的多种学科关于生命活动规律、疾病及转归机制、药物作用机制的研究开辟了广阔的前景。Neher和Sakmann也因其杰出的工作和贡献，获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 在兴奋过程中离子移动数量之多，速度之快，使人们推测在兴奋时膜结构中有特殊的蛋白质通道的存在。但由于当时技术所限，未能阐明。直至1976年Neher和Sakmann首次运用一种被称为膜片钳(patch clamp)的新记录方法，记录膜结构中单一的离子通道的开放和关闭，引起的单通道离子电流和电导，从而揭开了离子通道研究的新篇章。 Neher和Sakmann的贡献 Neher和Sakmann将直径1~5μm的玻璃微电极在火上抛光，然后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧密接触。电极尖端与膜之间的接触，使尖端内的小片膜与其余部位在电学上绝缘，形成50MΩ封接，保证了电流经微电极进入测量电路。以后，Neher又作了改进，用负压轻吸微电极造成管口与膜脂质双层之间非常紧密的封接（千兆欧封接）。千兆欧封接有两个重要后果，首先，小管内和细胞外液之间的电阻高达100千兆欧姆，因此在同一钳位电压下，膜单离子通道开放和关闭引起的离子电流、电导以及通道开放的时间机率及通道的动力学特性等皆可被测定。 第二，微电极尖端管口和膜之间封接的机械强度不同，可以产生几种不同的记录方式。不同的记录方式可用来研究通透性的不同方面。微电极尖端管口所围绕的细胞膜就是要观察离子通道变化的“膜片”，如果在这一小片膜上只含有一个或少数几个通道蛋白分子，则可通过离子通道电导的特点，测定出单一通道开放时的离子电流，从而对单通道的功能特性进行分析。他们应用这套技术顺利地记录了蛙肌肉细胞上单一离子通道电流。结果显示，蛙肌肉细胞的细胞膜上一个离子通道可通过的电流约为20×10-12A，换成离子数目大约是每秒通过一亿个离子。此后，他们又对离子通道的运作，细胞分泌过程及通道的调节功能进行了研究。 A显示出玻璃微电极接触进入至细胞中。B则是使用高级放大仪，将膜上的离子通道与微量吸管的尖端相触，以放大一部分的细胞膜。其中，微量吸管内连接了电流放大器。D表示电流通过离子通道，离子通道开启。C为通道的高度放大：细胞外覆有受体以及离子滤器。 膜片钳技术原理图 Faraday cage Vibration Isolation Table Microscope Micro-Manipulators Remote Controller Amplifiers CCD Camera Electrophysiology-Apparatus Micro-Manipulators DAD-VC system CCD Camera Electrophysiology-Apparatus Patch clamp 首先建立的单通道记录法（single channel recording）是细胞吸附式（cell-attached mode），其后又建立了膜内面向外模式（inside-out）和膜外面向外（outside-out）的模式。后来，又分别建立了开放细胞吸附内面向外模式（open cell-attached inside-out mode）和穿孔囊泡外面向外模式（perforated cell-attached inside-out mode）。全细胞记录法是指在常规的方法的基础上，附加穿孔膜片（perforated patch）