chap02 工具酶.ppt

第二章 工具酶 nuclease ligase polymerase modifying enzyme 2.1.1 R-M的分子机制 R-M的生物学意义 保护自身DNA不受限制 破坏入侵的外源DNA ?R?M+ or R?M? 2.1.2 RE的类型及命名 E. coli K→RE (1968) 流感嗜血菌→Hind II ?RE: 3819, 商品624 ?MTase: 844, 32 2.1.3 II型RE的基本特性 1. 回文结构 2. 切割频率 ? 4 bp: (1/4)4 ? 6 bp: (1/4)6 ? 8 bp: (1/4)8 2.1.4 同裂酶与同尾酶 同裂酶 (isoschizomer) ?识别序列相同, 切割方式相同或不同 Msp I→CCmGG yes; Hpa II, no Sma I: CCC↓GGG Xma I: C↓CCGGG 同尾酶(isocaudamer) 一组来源不同,识别序列各异,酶切后产生相同黏端的酶 Bgl II A↓GATCT Sau 3A ↓GATC Bam HI G↓GATCC 2.1.5 酶解反应的操作 酶切反应条件 Tris-HCl 50 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM DTT 1 mM NaCl 0?100 mM V: 20?100 ?l; T: 37 ℃ 1?1.5 h RE的使用 1 U: 在最佳反应条件下, 1 h内完全水解 1?g DNA所需的酶量 酶切反应: 酶量﹤? 1. 酶切方式 盐浓度不同的酶双切 同切(酶成本) 低盐先切, 补盐 切后更换buffer 2. 终止酶反应的方法 ?加EDTA ?0.1%SDS ?65℃, 20 min ?酚-氯仿, alc↓ 样品纯度、甲基化、构型 反应温度、buffer 星号活性 Dam→5?-GAmTC-3? ?MboI no; BamHI yes Dcm→5?-CCmAGG-3? EcoR II no 宿主基因型: M? star activity 非最适反应条件下, 识别与切割序列的非特异性 ?EcoRI:甘油＞5% 切5?NAATTN3? 离子强度对酶专一性的影响 100U Bam HI→1?g pBR322 ?100 mM NaCl, 1个切点 ?50 mM, 2个切点, ?条带 ?浓度更低, 切点更多 ?Tris-HCl 50?100 mM pH 7.5 ?MgCl2 10 mM ?ATP 0.5?1 mM ?DTT 5 mM 10?20 ?l; 4?15 ℃ 4?16 h 4. 影响连接反应的因素 反应温度 酶浓度 ATP浓度 底物浓度 DNA pol I及Klenow T4 DNA pol T7 DNA pol及测序酶 Taq DNA pol reverse transcriptase 2.3.2 Klenow酶 2.3.3 T4 DNA pol ?聚合和3’→5’外切 ?有dNTPs, 聚合 ?无dNTPs, 外切 ?1种dNTP, 外切至互补Nt 2.3.4 T7-DNA pol sequenase ?持续合成能力最强 ?3’→5’外切, 比K酶高1000? ?引物延伸; 3’末端标记 ?seq酶: 无外切, 聚合↑3倍 2.3.5 Taq DNA pol 嗜热水生菌 ?74℃延伸 ?聚合, Mg+2 ?5’?3’外切 逆转录酶类型 AMV: 禽成髓细胞瘤病毒 ?42℃, pH8.3, 强RNase H MMLV: 鼠白血病病毒 ?37℃, pH7.6 §2.4 DNA修饰酶 ?末端转移酶 ?T4-PNK ?碱性磷酸酶 1. 末端转移酶(TdT) 小牛胸腺; 聚合 ?无模板, Mg2+ 5’ P OH 3’ 3’ HO P 5’ ↓CIP 5’ HO OH 3’ 3’ HO OH 5’