一试验原理pGEX-6p质粒载体菌.PPT

一 实验原理 什么是质粒？ 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。 在pH12.0?12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。 分离质粒DNA有三个步骤： 培养细菌使质粒扩增， 收集和裂解细菌， 分离和纯化质粒DNA。 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒： 共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂； 超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂； 松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂； pGEX-6p质粒载体菌, LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素）， 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I）， NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)， RNase A， 95%乙醇，70%乙醇， TE buffer（pH8.0）。 1 氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20?C保存）， 2 配制LB培养基 （胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200?L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121?C 20min灭菌）； 3溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）； 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895?104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）； 溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml）， 4 70%乙醇（-20?C保存）， 5 TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）； 6 摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121?C 30min）。 1 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。 2 取出保存pGEX-6p载体的菌种, 在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于5ml无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37?C摇床中摇20h。 3取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，12000 rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。 4在沉淀中加入用冰预冷的100?l 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。 5加入200?l 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，插入冰中，放置5min。 6 加入用冰预冷的150?l 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。 7 12000 rpm离心5min，小心吸取400?l 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800?l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。 8 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500?l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净, 9 再加入500?l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。 10 离心管倒置于37?C培养箱中（或室温）空气干燥10分钟。。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。 11 每管加入10?LTE缓冲液混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认，用记