第六章 常用子生物学技术的原理及应用.ppt

PE 3700型DNA测序仪 DNA自动测序结果举例 五、生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选 常用蛋白质相互作用的研究技术 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 （一）标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 （二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 （一）电泳迁移率变动测定 放射自显影 未结合探针 结合有蛋白的探针 标记探针 1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 未标记探针 10X 凝胶迁移实验结果示意图 凝胶迁移实验结果图 染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。 （二）染色质免疫沉淀法 染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图 六、遗传修饰动物模型的建立及应用 The establishment and application of heredity-modified animal model 转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) ——目的基因的受体动物 一、转基因技术 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 二、核转移技术 有目的去除动物体内某种基因的技术, 称为基因剔除（gene knock-out）或基因靶向灭活(gene targeting)。 三、基因剔除技术 四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型 思 考 题 1．试述分子杂交与印迹技术的原理。 2．试述PCR技术的基本原理及其应用。 3．试述酵母双杂交技术的基本原理。 4. 简述基因芯片的原理. * * 一个质粒的基本结构 * * 显色反应的平板，白色菌落为有插入片段的克隆 * Northern blotting　结果 由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越来越少 （三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹) 首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。 与DNA和RNA印迹相似之处 蛋白质的转移只有靠电转移。 蛋白质的检测以抗体作探针。 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。 与DNA和RNA印迹不同之处 Western blotting应用 检测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。 Western blotting应用 SDSpurified recombinant human CK2α subunit and its Western blotting 用已知的特异抗体检测目的基因蛋白 三种印迹技术的比较 Western blotting 垂直槽 Northern blotting 水平槽 Southern blotting 水平槽 斑点或