农业大学生物化学-6.pptVIP

* （1）酶法（双脱氧法、末端终止法） * 返回 * 2、tRNA的三级结构 倒“L”形，所有的tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似的三级结构。 * （二）rRNA的高级结构 大肠杆菌16SrRNA和5SrRNA的二级结构 返回 * 第四节、核酸的理化性质 一、核酸的水解 （一）核酸的酸解 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解； * 糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解； 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定； 对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。如： DNA在pH1.6于37℃对水透析，可完全除去嘌呤碱，得到无嘌呤酸（apurinic acid）。 * （二）碱水解 1、RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 原因： RNA的核糖上有2`-OH羟基，在碱作用下形成磷酸三酯；磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2`，3`-环磷酸酯；环磷酸酯继续水解，产生2`-核苷酸和3`-核苷酸。（图） 2、 DNA的磷酸酯键不易被碱水解， DNA一般对碱稳定。 * * （三）酶水解 1、水解核酸的酶 （1）磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键的酶。 催化寡核苷酸及多核苷酸中双重酯化的磷酸分子进行水解的酶类。如：3`，5`-cAMP磷酸二酯酶。 （2）核酸酶（nuclease）：专一水解核酸的磷酸二酯酶。 * 2、核酸酶的分类 （1）按照对底物作用的方式 核酸内切酶（endonuclease）和核酸外切酶（exonuclease） （2）按照磷酸二酯键断裂的方式 在3`-羟基与磷酸基之间断裂 在5`-羟基与磷酸基之间断裂 * （3）按照底物专一性 核糖核酸酶（RNase）和脱氧核糖核酸酶（DNase） * 3、限制性内切酶 限制性内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶（restriction enzyme）；存在于原核生物中；催化对外源DNA的降解；识别DNA中特异的碱基序列，将DNA分子剪切为数量不多的片段（限制性片段）；为基因工程最重要的工具酶。 * 限制性内切酶的特征 ① 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 ② 粘性未端，平整末端 * 举例:  * 二、核酸的酸碱性质 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质，为两性电解质。 核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为4~5，RNA的pI约为2.0~2.5，在pH7~8电泳时泳向正极。 * 三、核酸的紫外吸收 （一）核酸的紫外吸收特性 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。 * （二）核酸的紫外吸收特性的应用 1. 作为定量测定核酸的方法。 2. 鉴定核酸样品的纯度。 A260/A280比值：纯DNA=1.8；纯RNA=2.0；样品中含有杂蛋白， A260/A280比值明显降低。 3.可判断核酸是否发生变性或降解。 ①增色效应（hyperchromic effect）：当核酸变性或降解时，其紫外线吸收强度显著增高 ②减色效应（hypochromic effect）：变性的核酸在一定条件下恢复原有性质时，其紫外线吸收强度又可回复到原有水平。 双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。 * 四、核酸的变性、复性和杂交 （一）核酸的变性(denaturation) 1、核酸的变性：核酸双链螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键的断裂。 与核酸的降解区别开。 2、引起核酸变性的因素 加热、强酸、强碱、有机试剂（尿素、甲醛、甲醇、乙醇、甲酰胺等）或射线等一切可以破坏核酸分子氢键的处理，都可使核酸变性。 3、变性DNA的特征 紫外吸收增强；粘度降低；浮力密度升高；比旋下降；生物功能减小或消失等。 * 4、DNA的热变性 DNA热变性是在一个很窄的温度范围内发生的。 DNA的融解温度(Tm)：或称熔点，在核酸加热变性过程中，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏时的温度，又称为核酸的解链温度。（即在260nm下光吸收达到最大光吸收一半是的温度） DNA的Tm值一般在82~95℃之间。 * 与Tm值有关的因素 ① G＋C所占总碱基数的百分比——成正相关 经验公式： Tm=69.3＋0.41(G+C)% 或（G+C）%=（ Tm-69.3）×2.44 ②离子强度 溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽。因此，DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 ③均一性 均质DNA：热变性温度范围较小； 异质DNA：热变性温度范围较宽。 * 5. RNA的变性 转变不如DNA明显，随着温度的升高， RNA 中双链部分的碱基堆积会逐渐减少，吸光值逐渐地、不规则地增大； Tm值较低。