植酸霉霉的测定09024201.ppt

植酸酶霉活的测定 制作人：舒诚明 组内成员：熊一虎，赵峥嵘，万雷名 一、实验原理 植酸酶活性单位定义为：样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释1 无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。 在酸性溶液中正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者当还原剂存在时，立即转变成蓝色的还原物，其在波长660nm处有最大吸收峰，比色的最适范围为1～10ug无机磷。 μml 二、实验试剂 1.乙酸缓冲液c为0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠1000mL容量瓶中，加约2.8mL浓盐酸调节pH至5.0～5.5，并用蒸馏水定容至1000mL 2.植酸钠溶液c为3.0mol/L：称取0.1981g肌醇六磷酸与100mL容量瓶，用乙酸缓冲液（1）溶解并定容至刻度。 3.10%TCA:10gTCA溶于100mL蒸馏水。 4.2.5%钼酸铵溶液：称取1.25g钼酸铵溶解于50mL蒸馏水。 5.10%Vc溶液：称取5gVc溶于50mL蒸馏水。 6.17%硫酸溶液 7.磷酸二氢钾（标准磷液10μg/mL）：用母液稀释一定倍数。 8.显色液配置：（6）：（水）：（4）：（5） =1：2：1：1 这是显色液 这是植酸钠溶液 这是乙酸缓冲液 三、实验仪器 恒温水浴锅、分光光度计、离心机、电子称、烧杯、容量瓶、移液管。 四、实验步骤 1.标准曲线的制作 （1）按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液。 标准序号 标准磷/mL 蒸馏水/mL 无机磷/μg 显色液/mL OD660nm 1 0 3.0 0 3 0 2 0.2 2.8 2 3 0.108 3 0.4 2.6 4 3 0.219 4 0.6 2.4 6 3 0.329 5 0.8 2.2 8 3 0.472 6 1.0 2.0 10 3 0.524 （2）显色反应：将上表中反应液立即摇匀，37℃水浴锅保温20分钟，冷却至660nm时测OD值，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标列出直线回归方程y=ax+b. 这是在水浴锅保温中 这是在测标准磷的吸光值 2.样品中植酸酶活力的测定。 （1）酶液的制备 取上次实验中摇瓶培养液2瓶，若培养液清亮，则不需要离心，混作就需要在3000rp离心15分钟，不需要稀释，备用。 这是我们上次摇瓶培养液 反应顺序 试管A 试管a 试管B 试管b 空白对照A 空白对照B 1.加酶液 0.3mL培样液A 0.3mL培样液A 0.3mL培养液B 0.3mL培养液B 0.3mL培样液A 0.3mL培样液B 2.加植酸钠/TCA 0.9mL植酸钠 0.9mL植酸钠 0.9mL植酸钠 0.9mL植酸钠 0.9mLTCA 0.9mLTCA 3.加乙酸缓冲液 0.9mL 0.9mL 0.9mL 0.9mL 0.9mL 0.9mL 4.混合均匀 √ √ √ √ √ √ 5.37摄氏度水解 水浴30分钟 6.加TCA/植酸钠 0.9mLTCA 0.9mLTCA 0.9mLTCA 0.9mLTCA 0.9mL植酸钠 0.9mL植酸钠 7.加显色液 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL 8.混匀37度水浴 水浴显色20分钟 9.比色测DO值 2.957 2.825 3.096 2.980 0 0 （2）酶活力测定 用10mL试管按下面反应顺序进行加液，用空白实验作对照，在660nm处测各实验的OD值。 五、实验结果与分析 (1)把上表所测的吸光值带入标准磷的直线回归方程y=0.055x+0.000得 每个试管的无机磷的质量 试管 试管A 试管a 试管B 试管b 无机磷m/g 53.76 51.36 56.29 54.18 平均无机磷m/g 52.56 53.24 (2)酶活力的计算法 酶活力=(F x m)/(30 x 31 x V) 所以计算的：A培养液中酶活力=(1 x52.56)/(30 x 31 x 3)= 0.0188(U/mL) B培养液中酶活力=(1 x53.24)/(30 x 31 x 3)= 0.0191(U/mL) 注释：F—试样液反应前的总稀释倍数。 m —根据标准磷曲线方程计算所得无机