(食品酶学)第三章酶的分离纯化.ppt

酶的分离纯化：是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，获得与使用目的要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程。 酶纯化的必要性：一种生物体含有数以千计的不同的分子，它们包括复杂的高分子量化合物，例如蛋白质、核酸、碳水化合物和复合脂肪以及小分子的有机酸、碱、糖和盐。生物体在细胞水平上精确地组织使得酶的分布不是均一的。 如果需要研究一种酶的氨基酸组成、分子量、三级结构、底物特异性或动力学参数，那么就必须将酶与其它所有物质分离。在这种情况下，酶的纯化将是一项重要的工作。 迄今为止，科学家们已把300多种酶制成了结晶，达到了相当高的纯化程度，并发展了各种类型的分离纯化方法。 酶的分离、纯化目的：在于获得一定量的、不含或少含杂质的酶制品或者提纯为结晶，以利于在科学研究或生产中应用。 生物工程是属于高新技术领域的系统工程 酶工程整个过程包括： 上游工程 (Up stream process, 缩写 UPS） 下游工程(Down stream process, 缩写DSP） 上游工程包括酶学基本理论、产酶动植物和微生物种的改良，采用基因重组或细胞融合改造产酶菌株，以及研究开发新的酶源，为开发利用提供科学依据。 下游工程属整个系统工程的后处理工艺技术，解决如何提高酶和最终产物回收率以及纯度质量问题。 酶的分离、纯化属生物技术的下游工程（Down stream process), 是提高产品获得率的关键。 酶的产量是以活力单位表示的，因此，在整个分离过程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测。只有这样才能确定酶的分离、纯化程度。 以固定化酶、固定化细胞为重要内容的酶工程技术是当今生物工程的重要组成部分。 食品酶学应用范围广阔，在整个生物工程领域离不开酶学的应用。 第一节 细胞破碎 已知的约3000多种酶中，除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞之内。为了将细胞内的酶进行提取和分离纯化，就得将收集的细胞或组织破碎。 对于不同的生物体，或同一生物体不同组织的细胞，由于各自的结构不同，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同。因此，必须根据具体情况选用适宜的方法，以便达到预期的效果。 细胞破碎的方法 细胞破碎的方法很多，归纳起来可分为： 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶学破碎法等 一、机械破碎法 通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。 常用的有如下几种： 捣碎法 研磨法 匀浆法 1．捣碎法 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。转速可高达10000r/min。 常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞破碎，也可用于微生物，特别是细菌的细胞破碎，此法在实验室和生产规模均可采用。 使用方法：先将组织细胞悬浮于水或其它介质中，置于捣碎机内进行破碎。 2．研磨法 利用研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。 必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。 在研钵中用作研磨，细胞破碎后，用水或缓冲液抽提，抽提出来的溶液即为粗酶液。 研磨法设备简单，可用人力研磨也可用电动研磨，常用于微生物和植物组织细胞的破碎，但效率较低。 试验举例 酵母异柠檬酸脱氢酶的制备 以新鲜面包酵母为材料，称取面包酵母10～15 g，加入在冰浴中的 20 ml 0.1 mmol/L碳酸氢钠溶液及 10～20 g干净的玻璃砂，置于研钵中研磨。酵母细胞壁比较坚硬，有时需要反复研磨，也可适当调节酵母与玻璃砂的比例。再于 660 g下离心 10 min，然后收集上清液。最后在高速离心机中 1000 g离心 l h，此时得到的上清液即为含酶溶液。 此法简单，无需特殊设备，但产量低，难于大规模操作，需要在冰浴中或冰室中操作。如用干冰或液氮冷却后进行研磨，则不必加入磨料。 3．细菌研磨法 1957年中国科学院王大深教授等设计的细菌磨，已推广应用于小型微生物细胞研磨，使用效果好，破碎率达到 99.99％。其基本结构如右图所示。主要由研磨和动力两个部分构成。 细菌磨研磨部分包括： ①长15cm、直径5cm硬质磨玻璃管作滚筒，滚筒内可以装碎冰，以保持低温操作。 ②一个与半面滚筒面密切贴合的凹面瓷质承座。玻璃管连接，滚筒与承座相互贴紧，承座底下垫以强有力的弹簧。动力