生物化学第二章节蛋白质化学下课件幻灯片.pptVIP

* 透析(dialysis): 磁力搅拌器 透析前 透析后 透析袋 　　通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。 形成稳定胶体溶液的因素： 水化膜和同性电荷 蛋白质所带电荷和其周围包绕的水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳 定的两大因素。脱水和中和电荷可以导致蛋白质的沉淀。 水化膜 正电荷 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? H+ OH- OH- OH- H+ H+ 脱水 脱水 脱水 蛋白质 在等电点时的亲水胶体 带负电荷的亲水胶体 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 带正电荷的亲水胶体 带正电荷的疏水胶体 不带电的疏水胶体 （极易沉淀） 带负电的疏水胶体 负电荷 二 两性解离和等电点 pI pH pH ﹤ ﹤ 三 蛋白质变性作用和复性 牛胰核糖核酸酶分子的变性与复性 变性是指蛋白质在一些理化因素的作用下，其正常的空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，导致蛋白质的理化性质的改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性的丧失。蛋白质的变性不影响其一级结构。 三 蛋白质变性作用和复性 变性 物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等 沉淀 改变pH至pI 破坏水溶液中蛋白质 的水化膜和中和电荷 （变性蛋白质） （蛋白质未变性） 凝固 加热 （变性，不再溶解） 变性不一定沉淀 沉淀不一定变性 凝固均变性并不溶解 加热 蛋白质变性（Denaturation） 蛋白质复性（Renaturation) 四 蛋白质沉淀（sedimentation）作用 precipitation（沉淀）； Aggregation（凝集） 1 中性盐法 盐析（salting-out）；分段盐析（grading salting-out） 重金属盐 2 有机溶剂 乙醇；丙酮 3 生物碱 单宁酸；苦味酸 4 有机酸 三氯乙酸 第六节 蛋白质分离纯化与测定 一 一般原则步骤 材料获得与破碎（机械、渗透、冻融、超声和酶解等） 蛋白抽提 蛋白粗体（沉淀） 蛋白质分离（精纯化） 测定：浓度；纯度；分子量；性质功能鉴定等 蛋白质的理化性质与常用的纯化方法 二 蛋白质的提取与纯化原理 （一）改变蛋白质的溶解度 盐析： 高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出 有机溶剂沉淀： 降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间 相互吸引而沉淀 （二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法 离心(centrifugation)： 利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密 度的物质进行分离 根据转速分类：常用离心机 10 000 rpm 高速离心机 20 000~25 000 rpm 超速离心机 50 000 rpm 相对离心力（×g）= 1.119 × 10–5 × （rpm）2 × r 根据应用分类：分析型离心机 制备型离心机 [g: gravity, rpm: revolution per minut, r: 离心半径] 匀浆 沉淀 上清 1 000?g,5min 上清 上清 上清 上清 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 4 000?g,10min 15 000?g,20min 30 000?g,30min 100 000?g,90min 100 000?g,180min （未破坏的 真核细胞） （细胞膜碎 片，细胞核） （线粒体， 细菌） （溶酶体， 菌体碎片） （微粒体） （核糖核蛋白体） 胞液 亚细胞成分的差速离心分离 差速离心法是沉降速度离心的一种，采用离心力由小到大的分阶段离心的办法，将密度不同的物质分步骤地逐一分离开来。亚细胞结构的分离就是其中最好的例子。 差速离心法 几种蛋白质的分子量与沉降系数的关系 在单位力场下，溶质分子的沉降速度与离心角速度、离心半径呈正比，其比例常数为沉降系数，用S表示，单位为秒。 = s· ?2 ? 一般蛋白质的沉降系数为10?13?10?12秒，故人们以Svedberg(S)单位来表示沉降 系数，即1S = 10?13秒。沉降系数的大小与蛋白质的密度和