生物化学-第三章节核酸化学幻灯片.pptVIP

二.印迹技术与分子杂交 （一）.印迹技术 概念:核酸的杂交中，经过凝胶电泳分离的DNA/RNA分子，杂交之前通过毛细管吸附作用/电导作用将凝胶中DNA/RNA分子原封不动地转移到滤膜上。 滤膜:硝酸纤维素滤膜， DEAE-纤维素滤膜 印迹种类: Southern blotting:（1975） Northern blotting:（1979，Alwine) （1979，Towbin,Immunoblotting-Western;1982, Reihart,Eastern) 电转移技术:(1983,Aubertin) （二）.核酸杂交 核酸杂交的概念:DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸杂交方法： Southern blotting杂交技术: Northern blotting杂交技术: 点杂交技术: 菌落/噬菌体的原位杂交技术: （三）.杂交检测方法—放射自显影 点杂交 三.PCR技术-DNA Polymerase Chain Reaction （一）基本步骤 引物1pmol/ul,dNTP200umol/l, Taq酶2u/100ul 94 ?c 5-10min 褪火45s-60s 保温72 ?c1min （二）PCR技术的应用 1. 遗传病，疑难病的诊断及产前检查 2 .病原体的检测 3 .癌基因的检查 4 .基因组测序 5 .基因探针的制备 6 .基因突变的分析及定位诱变 7 .cDNA库的构建,DNA重组,基因分离与克隆 8. 法医及刑事鉴定 （三） PCR技术的特点 1 .引物設计:(引物的长度一般为18～25bp) 扩増长度一般在200～800bp之间 2 .扩増效率: 2n,DNA量增加106～109倍 3 .扩増温度: G＋C含量和Tm值,一般在40－60%之间， 两条相差2－3 ℃, 72 ℃. 4.末端核苷酸:3’端不得有任何修饰 第三节 DNA的分子结构 一、DNA的一级结构及测定 1.加减法 ATGCTG 3’ 5’ 5’ 3’ ATGCTG 3’ 5’ 5’ TACGAC TACGA TAC TACG TA T DNA聚合酶 4种dNTP(一种为α-32P-标记） 模板 引物 ATGCTG 3’ 5’ 5’ TACGAC TACGA TAC TACG TA T +A -T -C -G -A +T +C +G TACGA TA TACG TACGAC TAC T TACG T TAC TACGA TA +A +G +C -G +T -A -C -T 电 泳 方 向 读 带 方 向 新合成链的5’ 3’ 2.双脱氧法 ATGCTG 3’ 5’ 5’ 3’ DNA聚合酶 4种dNTP(一种为α-32P-标记） +ddATP +ddTTP +ddCTP +ddGTP TACGddA TddA TACGAddC TAddC TACddG ddT 3’ TACGAC TACGA TAC TACG TA T +ddA +ddT +ddC +ddG dNTP﹕ddNTP 的比例最好为 1﹕100 3.化学修饰法 修饰及断裂条件 碱基 修饰试剂 断裂条件 A+G G T+C C 甲酸 硫酸二甲酯 肼 肼+盐 哌啶 加热 哌啶 哌啶 被测定链的5’ 3’ 二.DNA的二级结构 2.0 nm 小沟 大沟 要点： 1.多核苷酸链的走向 2.螺旋的角度.高度.直径 3.碱基分布及配对规律 4.作用力 （一）双螺旋提出的基础 （二）双螺旋结构要点 双螺旋DNA的结构参数 类型 旋转方向 结晶状态 螺旋直径（nm） 螺距（nm） 每转碱基对数目 碱基对间垂直距离（nm） 碱基旋转角度 A－DNA B－DNA C- DNA z－DNA 右75%Na+ 右92%Na + 右66%Li + 左 人工合成 2.0 2.3 1.92 1.8 2.8 3.4 3.1 4.5 11 10 9.3 12 0.255 0.34 0.33 0.27 32.7o 36o 38o -60o （三）双螺旋的结构类型 （四）左旋DNA—Z-DNA 要点 1.左旋锯齿状 2.碱基向外 3.只有小沟 4.12bp，4.56nm （五）.绞链DNA（hing-DNA 即H-DNA 要点 ： 1.三联体碱基配对方式 2.第三链位于大沟中 3.两条链反平行排列 4.酸性PH或负超螺旋张力下 B-DNA H-DNA 三、DNA的三级结构 DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构。 正超螺旋 负超螺旋 双链线性DNA（dsDNA） 如真核生物