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第五章 菌株保藏的原理和方法 5 The Principals and Methods for Strain Preservation 提纲 菌种保藏的原理和思路 斜面保藏法和穿刺保藏法☆ 冷冻干燥保藏☆ 低温保藏技术(甘油管保藏)☆ 沙土管干燥保藏法 液氮保藏☆ 悬液保藏法 菌种保藏的意义 微生物菌种是重要的资源 工业生产、科学研究。 各国都非常重视，成立了各自的菌种保藏机构，知名的有： ATCC（美国标准菌种保藏所）; NRRL（美国农业部的保藏所）; CCGMC（中国普通微生物菌种保藏中心） 菌种保藏的思路 菌种保藏应达到的效果 1）菌种存活； 2）不变异或退化。 要达到这个效果可采用的手段 低温； 寡营养； 缺氧； 模拟自然条件(如沙土管)。 一、斜面保藏法和穿刺保藏法 1、斜面保藏法 将菌种接种在斜面上，待长好后，放入4℃下保藏。1月以内。 2、石蜡油封存法 将菌种接种在斜面上，待长好后，在其上覆盖石蜡油，放入4℃下保藏。1年以内。 3、穿刺保藏法 将菌种穿刺接种到软琼脂培养基中，待长好后，在其上覆盖石蜡油，放入4℃下保藏。软琼脂培养基的成分和斜面相同，但琼脂的加量为1%，高度2cm，穿刺在其高度一半处。1年以内。 长好的含义：细菌或酵母进入对数生长期末期；霉菌和链霉菌长至孢子成熟。 斜面保藏法 穿刺保藏法 二、真空冷冻干燥保藏法 原理： 使活的菌种在干燥、低温、无氧的环境下保藏，其生长代谢活动处于停滞状态，利于长期保藏。 方法： 在有保护剂、低温的条件下下快速将微生物细胞或孢子冷冻，在减压下使水分升华，干燥后密封，隔绝氧，这样可以长期保存。 优点：保藏时间长（数年），可在常温下运输。 具体步骤： 安培管的处理。 菌悬液制备。使用最优的培养条件培养细胞或孢子，成熟后，用保护剂洗下孢子或细胞，制成菌悬液，然后加入0.1-0.2ml灭菌的安培管中，塞好棉花塞。 冷冻干燥。开启冷冻干燥机，预冷，放入安培瓶，待温度达到-30℃－-15 ℃时，开始冷冻。冷冻后，抽真空，由于样品在升华，温度会持续降低。干燥完毕后，取出安培管在多孔管道上再抽真空并封口。 安培管在4-5 ℃下保藏（5-10年），在室温下短暂保藏也不会有很大影响。 三、低温保藏法 多数微生物在-20 ℃低温下可保藏1年以上，在-80 ℃低温下可保藏数年。 方法：对数生长后期的细菌、酵母，或培养成熟的孢子，加入15%的甘油或二甲亚砜中（这两种物质均为保护剂），放相应的温度下冷冻即可。 四、沙土管干燥保藏法 原理： 模拟微生物在自然界中存在的环境。(微生物在自然状态下生存于土壤中) 方法： 将沙土洗净、烘干后过筛，混匀（沙：土约1~2：1）、分装后灭菌。 将菌液加入后真空抽干封口，放干燥器或4 ℃下保藏。 可保藏1年至数年。 五、液氮保藏法 原理： 超低温下菌种非常稳定；加入保护剂条件下冷冻的菌种不死。 方法： 将菌液加入到灭菌的保护剂如甘油、二甲亚砜中，在液氮（-196度）中冷冻。有的菌种需预冷后再放入液氮中。 解冻时最好先在38-40 ℃条件下振荡1-2min溶化。 可保藏数年至十余年。 六、悬液保藏法 原理： 寡营养保藏。适用于丝状真菌、酵母及肠道细菌。 方法： 将菌种放入蒸馏水、生理盐水或磷酸缓冲液中室温下保藏。 一年 Thanks for Your Attention! * * 缺点：这还包括负变，因此得到优良菌种的机率极小。 * * 缺点：这还包括负变，因此得到优良菌种的机率极小。