Ti质粒技术介绍.ppt

（四）Ti质粒载体及其构建 1. 植物基因工程载体命名规则 2. 植物基因工程载体种类 3. 植物基因工程载体构建 4. 载体构建中常用的选择标记基因 1 植物基因工程载体命名规则 （1）天然存在的质粒第1个字母大写，并用括号括起来，如(ColＥl)。 （2）重组质粒用小写p (Plasmid)后加两个大写字母表示：大写字母指构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构，如： pSCl0l : SC (Stanley Cohen人名), pMT555:MT(Manchester Technology)曼彻斯特理工学院。 （3）农杆菌中的质粒一般在命名中要表示出来。如pTiT37，Ti表示根癌农杆菌，T37表示质粒编号或分类。 2 植物基因工程载体种类 （1）目的基因克隆载体：目的基因克隆载体与微生物基因工程类同，通常是由多拷贝的E.coli小质粒为载体，其功能是保存和克隆目的基因。 （2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大肠杆菌质粒插入T－DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。它是构建中间表达载体的基础质粒。 2 植物基因工程载体种类 （3）中间表达载体：中间表达载体是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。 （4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：植物基因转化载体是最后用于目的基因导入植物细胞的载体，故亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。根据它的结构特点又可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统。 * 专题 植物基因工程载体 一、根癌农杆菌及Ti质粒 二、Ri质粒载体 三、CaMV（花椰菜花叶病毒）载体系统 四、脂质体（liposomes）载体 一、根癌农杆菌及Ti质粒 （一）根癌农杆菌与冠瘿瘤 （二）Ti质粒及T-DNA的结构与功能 （三）T-DNA的转移 （四）Ti质粒载体及其构建 （一）根癌农杆菌与冠瘿瘤 植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的因素有：受伤、昆虫、病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿是冠瘿瘤。 1. 冠瘿瘤的起因 由根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）[属根瘤菌科（Rhizobiaceat）]对植物的侵染而引起。 2. 冠瘿瘤的侵染过程 细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。 冠瘿瘤 上： 电镜下的根癌农杆菌 下： 冠瘿瘤 3.冠瘿瘤的一般生物学特性 （1）45℃杀死侵染植物的根癌农杆菌，植物组织仍然能形成癌。 把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上，能够无限制的分裂和生长。 （2）根癌农杆菌侵染植物后产生两种物质：类植物激素和冠瘿碱。类植物激素使细胞大量扩增，出现冠瘿瘤；冠瘿碱是受侵染植物组织合成的稀有氨基酸，包括胭脂碱、章鱼碱等。冠瘿碱是根癌农杆菌生活的C、N和能量来源。 （3）根癌农杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有一个叫作Ti（tumor-inducing）的质粒（Ti plasmid）。 （二）Ti质粒及T-DNA的结构与功能 1. Ti质粒 （1）Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为95～156× 106D，约有200kb。最近有人发现农杆菌中还有其它的质粒，称之为隐秘质粒。稳秘质粒的功能还不清楚，有的认为可能是缺陷型的Ti质粒。迄今已从多种植物中分离出不同种类的根癌农杆菌。 （二）Ti质粒及T-DNA的结构与功能 （3）Ti质粒的基因图谱 基因图谱：基因在Ti-DNA上的排列顺序。 基因图谱构建：转座子标签法 利用细菌的转座子（transposon），使Ti质粒发生嵌入突变和缺失突变。细菌转座子带有各种抗菌素抗性的基因，在转化过程中它们可嵌入Ti质粒，使根癌农杆菌带有相应的抗菌素抗性，因而可方便地筛选出转座子嵌入Ti质粒突变体。由于在转座子嵌入处的编码基因发生失活，因而可通过分析Ti质粒限制性内切酶片段的变化，如某些片段消失或电泳迁移率改变，确定这些基因插入位置，并且与突变体的表型相对应，从而建立Ti质粒的基因图。 胭脂碱型Ti质粒基因图谱 （示Ti质粒上产生冠瘿瘤的几个重要基因位点） （二）Ti质粒及T-DNA的结构与功能 （4） Ti质粒的基因位点及其功能区域 ① T－DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿