病毒包装与感染技术介绍.ppt

常见的慢病毒包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)、马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV ）和猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV ）。 HIV-1 HIV-1为单链RNA病毒，共有9个基因。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构，tat、rev为调节基因，vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因，编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。 gag -----群抗原基因，编码核心蛋白基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白等 pol -----多聚酶基因，编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、蛋白酶 env -----包膜蛋白基因，编码包膜蛋白gp120 及gp41，决定病毒感染宿主的靶向性 tat -----基因反式激活因子，参与HIV-1基因RNA转录的控制 rev ---- 病毒蛋白表达调节因子，能增加gag和env基因对结构蛋白的表达 vif -----病毒感染因子, 其作用是在一些细胞因子的协下促进HIV-1在细胞内复 Vpr -----R蛋白能使HIV在巨噬细胞中增殖 vpu -----U蛋白，能促进HIV从细胞膜上释放 nef ----负因子，具有抑制HIV-1增殖作用 LTR ----两端长末端重复序列，内含复制所需的顺式作用元件，如包装信号元件Ψ。 慢病毒载体系统组成 第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。 包装部分HIV-1前病毒基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件, 5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。 包装载体 表达载体部分与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用元件, 5’端LTR和全部5’端非翻译区域。 包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。 表达载体 包膜载体 三代慢病毒载体 第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进 在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因（vif、vpr、vpu和nef） 不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性 第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。 将rev基因单独放在一个包装质粒上。 增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，只保留了3个基因(gag、pol和rev)，更加安全。 lentivirus 包装流程 将293T 细胞传代至60%~70%汇合时，用脂质体法将4 个质粒共转染至细胞。 体外培养24 小时，荧光显微镜下观察，大量细胞表达绿色荧光蛋白，说明质粒转染成功。 培养48小时后，用超速离心收获含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。并进行感染293T 细胞的实验，感染48~72 小时后观察到约有70%细胞表达绿色荧光蛋白，说明病毒用很强的感染能力。 将被感染细胞传代1、2 和3次，在传代细胞中依然观察到绿色荧光蛋白的表达，说明包装的慢病毒具备感染和稳定转化宿主细胞的能力。 逆转录病毒载体 逆转录病毒即反转录病毒是一类RNA病毒，它能在逆转录酶的作用下将RNA反转录为cDNA，再经过DNA复制/转录/翻译等蛋白酶作用扩增形成病毒。 逆转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间，逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此，逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制。 逆转录病毒载体的特点 优点： 转染范围广，由于逆转录病毒的受体分布广泛，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; 转入的外源基因可完全稳定整合到宿主细胞染色体内，使得目的基因长期稳定表达； 对细胞感染率高 感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。 局限性： 只能感染分裂细胞； 能够插入的外源基因较小，难以满足较大基因的转移； 载体DNA整合人宿主染色体是随机的，并因随机整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，从而具有引发癌症的风险； 活体直接基因转移对病毒滴度要求高，病毒活体直接注射会受到补体影响而灭活等问题。 逆转录病毒的亲嗜性