[医学]协和考博分子生物学精选.docVIP

重要实验 1、RNA酶保护实验（RNase protection assay）：它在许多方面与S1核酸酶分析方法类似。它是用人工合成的具35S或32P标记的反义RNA探针同目的mRNA杂交，所形成的双链体分子用只切割单链的RNaseA和RNaseT1消化，之后将仍保留着的RNA做大小分部分离，于是被保护的RNA探针便给出了在样品中存在的目的mRNA的大小数值。此法同样可鉴定样品中mRNA的数量。 2、DNA酶足迹法（DNase footprinting）：也叫足迹实验（footprinting assay），是一种用来检测被特定蛋白特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构特征的实验方法。基本原理：当DNA分子中的某一区段同特异蛋白结合之后，便会得到保护而免受DNaseⅠ的切割作用，结果不会产生出相应长度的切割分子，于是在凝胶电泳放射自显影图片上便会出现一个空白区，俗称“足迹”。通过与没有蛋白保护的对照DNA序列比较，便可得知相应于足迹部位的核苷酸序列结构。 3、S1核酸酶定位法（nuclease S1 mapping）：用于揭示mRNA序列结构特征的一种技术。将从一个克隆基因分离的经放射性标记的单链DNA片段同其相应的mRNA退火形成双链分子，然后用S1核酸酶消化此杂合分子上未互补配对的单链序列，再用PAGE及放射自显影方法，检测保留下来的DNA片段的分子大小。此法可测定克隆基因中的内含子数目及大体位置，mRNA分子的5’端位置及mRNA5’端任何不均一性的程度。 4、染色体步移（chromosome walking）：借助反向PCR（inverse PCR）通过使部分序列已知的限制片段自身环化连接，然后在已知序列部位设计一对反向引物，经PCR而使未知序列得到扩增。重复进行反向PCR，从染色体已知序列出发，逐步扩增出未知序列，称染色体步移。 5、凝胶阻滞实验（gel retardation assay）：又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay）， 或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），或条带阻滞实验（band retardation assay）。它是根据裸露的DNA与结合有某种蛋白的相同大小的DNA在电泳中具有不同的迁移率（DNA-protein复合物由于具有较高的分子量，因此通过凝胶的速度要比裸露的DNA缓慢）这一原理，在20世纪80年代初期设计出来的用于检测与特定DNA片段相结合的特定蛋白的一种实验技术。目前也可用于RNA结合protein的研究。 6、甲基化干扰实验（methylation interference assay）：根据DMA能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能特异地切割甲基化的G残基这一原理设计的，用于研究protein与DNA相互作用的一种有效的办法。 7、Western blotting：即蛋白质印迹（protein blotting），是用来检测在不均一的蛋白质样品中，是否存在目标蛋白质的一种技术。其操作程序与Southern blotting十分类似。先将蛋白质作变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到诸如硝酸纤维素滤膜一类的固体支持物上，通过专一性抗体探测目标蛋白质。随后再用一种标记的第二抗体（如125I标记的或生物素化的羊抗兔的IgG）检测在印记中存在的免疫复合物（即第一抗体与抗原复合物）。由于本法是在变性和还原条件下进行凝胶电泳，因此目标蛋白质的分子大小是可被检测出的。 名词解释一 1、小分子G蛋白：单体蛋白，分子量20-30kD，与一般G蛋白α亚基有高度同源性并具有相似性，同时与Ras蛋白具有较高同源性，又称为Ras超家族，分为Ras、Rho、Arf、Sar、Ran、Rab六个亚家族，参与多种信号传递途径。其中Ras蛋白是细胞增殖与分化的关键调节因子，其基因的突变与许多人类肿瘤有关。2、大分子G蛋白（鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide binding protein，简称G蛋白））：G蛋白是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由三个亚基组成。他们是α亚基（45KD）、β亚基（35KD）和γ亚基（7KD）。G蛋白有两种构象，一种以αβγ三聚体存在并与GDP结合，为非活化型；另一种构象是α亚基与GTP结合并导致βγ二聚体的脱落，此型为活化型。功能：1、调节腺苷酸环化酶活性；2、调节视网膜cGMP磷酸二酯酶活性。3、调节磷脂酶C活性，促进IP3与DG的生成；4、调节离子通道。3、第二信使（secondary messenger）：在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内信息物质。通常将cAMP、cGMP、IP3、DG、Ca2+等这类在细胞内传