[医药]细胞培养室细胞培养技术.docVIP

皖南医学院病生细胞培养室细胞培养技术 细胞培养分为原代和传代两种培养方式，由于本室重点在于肿瘤细胞的传代培养，现将个人传代细胞培养的操作方法总结如下：如有不全或者不妥之处，请指正。 传代定义：将现有的经过鉴定的细胞株，从原培养瓶中加以分离，稀释后接种于新的培养瓶中的过程，即为传代。 1.无菌操作基本技术 （1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，并在照射后开启抽风扇20 分钟后，才能开始实验操作。每次操作尽量只处理一种细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 %酒精擦拭无菌操作台面，再开紫外线30分钟。 （2. 进出应该及时换鞋，在操作时应该穿戴无菌操作衣，口罩，一次性手套，一切物品进入无菌操作台，必须用酒精擦拭。 （3. 小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 （4、在无菌台操作时，尽量让培养瓶贴近酒精灯。 2. 定期检测下列项目： （1. CO2 钢瓶之CO2 压力 （2. CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染是否加硫酸铜(水盘的水用无菌水，每周更换)。 3.实验用品 （1. 种类︰ 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器必须高压消毒，其它均为一次性塑料无菌制品。 器材 20ml培养瓶 5ml吸管 离心管 酒精棉球 酒精灯 移液器 酒精 封口膜 冻存管 试剂 培养基（1640 高糖） 缓冲液 消化液 冻存液 胰酶 牛血清 双抗 设备 无菌操作台 离心机 倒置显微镜 CO2培养箱 -80冰箱 高压锅 4，实验步骤 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： （1、悬浮生长细胞传代 （1）将原代培养的细胞连同培养液一起转入离心管 （2）离心（800--1000转/分）离心5分钟后去上清 （3）沉淀物加新培养液后，吹打，再混匀按1：2传代。 （2、半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。视具体考虑是否使用消化液 （3、贴壁生长细胞传代 （1）吸光培养瓶中的培养液，用少量缓冲液冲洗培养瓶一次 （2）加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min。细胞贴壁特别牢固的可以放入培养箱加温，肉眼消化瓶底呈现流沙状或者显微镜下动态监测。 （3）吸去胰蛋白酶液，加入新培养液。（有时担心量少也可不去除胰酶，直接加培养液） （4）用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，（最好不要太多气泡）形成细胞悬液。 （5）视具体情况，需要分瓶者加入10ml,吸取5ml细胞悬液，接种于新的培养瓶内。如果不想分瓶而细胞太满可丢弃一半。 （6）在显微镜下观察妥当后，放入培养箱中培养。 5，培养液的配置 一般培养液没有一个固定比例，大致参考如下，89%培养基+ 10%胎牛血清+ 1%双抗 视细胞的生长需求胎牛血清可适当增加和减少（由于培养基不能久置，前期少量） 6.冷冻细胞复苏 冷冻细胞之复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 细胞活化后，约需一到数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常材料 （1.实验用品 37°C 恒温水槽（在复苏前就要开启） 新鲜培养液 无菌吸管 离心管 培养瓶 （2. 步骤： （1） 操作人员应戴手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害和冻伤。 （2）自—80冰箱取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 (3)迅速置于37 °C 水槽中回温，轻轻震荡，一分钟内取出，以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 (4) 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 7.细胞的冻存 (1、取对数生长期细胞，（细胞状态好）经胰酶消化后， (2、收集消化细胞于离心管中，800—1000r/min离心5min (3．弃上清液，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)； (4、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称冻存人和冷冻日期。 (5．依次放入4