1.2 基因工程的基本操作程序58PPT.ppt

【易误警示】　 (1)目的基因检测与鉴定的三个步骤，都是在体外进行的。 (2)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等标记含有目的基因的DNA片段。 * 【探规寻律】　 (1)PCR技术不需要解旋酶，但需利用90～95 ℃高 温使DNA分子解旋。 (2)PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核 苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。 (3)PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶 1.原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。 RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落) ①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编码区 非编码区 原核细胞的 基因结构 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 2.真核细胞的基因结构 真核细胞的 基因结构 编码区 非编码区 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。 非编码序列： 包括非编码区和内含子 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续 不连续 编码区 非编码 要点二　基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.基因表达载体的构建 (1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录。 (2)目的基因：编码相关蛋白质，形成基因工程产品或产生新的生物性状。 (3)终止子：一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。 (4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)。 3.基因表达载体应具备的条件 (1)对受体细胞无害，不影响受体细胞的正常生理活动； (2)能自我复制，能通过复制进行基因扩增； (3)具有标记基因，以便于鉴定目的基因是否进入受体细胞； (4)重组DNA大小应适合，以方便操作。 特别提醒　 (1)用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA分子的目的是产生相同的黏性末端，便于两者完成拼接。 (2)终止子与终止密码子的区别 ①终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位是脱氧核苷酸； ②终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基，其组成单位是核糖核苷酸。 【例1】 (2012·湖南师大附中高二检测)如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因,P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别含有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。 (1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoR Ⅰ 酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________________ 、________________ 、_______________ _ 三种。若要从这些连接物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_____________。 目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物　 分离纯化 (2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________。 (3)目的基因表达时，RNA聚