体细胞杂交4.PPTVIP

2006-11-15 第六章　体细胞杂交 第六章 细胞融合 1、细胞融合（cell fusion）概念： 细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术也称体细胞杂交（somatic hybridization） 、原生质体融合，是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生,形成新物种或新品种的技术。 2、细胞融合的意义 1）有性杂交变无性杂交,加快育种速度 2）打破远缘杂交的不亲和性 3）创造新细胞质杂种 4）单克隆抗体制备 3、细胞融合的一些基本概念 4、细胞融合的发展历史 1858年，菲尔绍夫报道了正常组织、发炎组织及肿瘤组织中出现多核细胞情况； 1875年，兰格第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞合并现象； 1962年，日本冈田善雄发现HVJ病毒能引起艾氏腹水肿瘤细胞融合成多核的现象； 1965年，英国海利斯进一步证实灭活的病毒可诱发动物细胞融合； 70年代,华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇PEG能促使植物原生质体的融合； 从这开始,始于动物的细胞融合也扩展到植物和微生物细胞. 二、体细胞杂交的原理与方法 1、原理（以植物细胞为例） ?、去除细胞壁以获得大量的原生质体 ?、诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近 形成细胞桥 – 最关键的一步 胞质渗透 细胞核融合 ?、筛选,培养,促进细胞分裂,分化, ?、从细胞团,愈伤组织到最后成株 2、方法 1）生物法——仙台病毒法 原理：病毒被膜具有凝聚细胞的能力，它一边黏连一个细胞的表面，另一边黏连另一个细胞的表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结，诱导细胞的融合。 病毒促使细胞融合的主要步骤： ?两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； ?通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； ?两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体； ?进入正常的细胞分裂。 2）、化学法 主要包括： 盐类融合法（NaNO3） 高Ca2+和高pH值诱导法 聚乙二醇（PEG）融合法 PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 ?、盐类融合法（NaNO3）的原理： 盐（如NaNO3）能中和原生质体表面的电荷，促进原生质体的聚集，诱导细胞的融合。 盐类融合剂种类 硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小； 缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合。 ? 、高Ca2+和高pH值融合 ?、Ca2+浓度 0.05 mol/L ? 、pH 9.5-10.5 具体做法(以烟草为例) a. 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合; b. 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; c. 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h; d. 用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； 两种原生质体的融合率达到10%。 ?. 聚乙二醇（PEG）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间。 PEG的作用机理： ? PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合； ? PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 PEG诱导原生质体融合过程 具体过程： ?收集原生质体； ?用PEG处理40-50 min； ?用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG； ?细胞选择与培养 PEG诱导融合的优点与缺点 优点： ?融合成本低，勿需特殊设备； ?融合子产生的异核率较高； ?融合过程不受物种限制。 缺点： ?融合过程繁琐； ? PEG可能对细胞有毒害。 ? PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥）； 然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合）； 再用培养液洗去高Ca2+和高pH值。 3）物理法—电融合法 原理： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 电融合操作基本过程 将制备好的亲本原生