质粒DNA大提试剂盒-经典法.doc

质粒DNA大提试剂盒-经典法 Classic Max Plasmid DNAout 货号: M090110 产品及特点 本试剂盒是用于质粒DNA大量制备与纯化的试剂盒。菌体先经碱裂解法处理，再通过离心吸附柱，专一结合DNA，最后洗去杂质，高效快速提取质粒DNA，全套操作可以在30分钟之内完成。使用本试剂盒可从50-100 mL过夜培养的菌液纯化得到高达300-500 ug的高纯度质粒DNA（OD260/OD280 = 1.8-2.0），可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。 快速、步骤少，整个操作在半个小时之内完成。 纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8-2.0之间。 产量高，每毫升过夜培养的细菌可以提取到2-5 ug/mL。 用途广，适用于低拷贝和高拷贝质粒。 价格低，比多数国内同类产品的价格更便宜。 规格及成分 成 份 5次包装 溶液A 30mL 溶液B 30mL 溶液C 40mL RNase A溶液 （2 mg/mL） 1.5 mL 通用洗柱液 100mL 大提离心吸附柱 5套 通用洗脱液 10mL 使用手册 1份 运输及保存 RNase A溶液需要4℃保存，其余成分可室温保存，如有沉淀可加热溶解后再使用。 使用方法 先将全部RNase A溶液全部加入到溶液A中，摇匀后再取用，未用完的溶液A最好在4℃保存。 用250 mL离心管收集100-300 mL菌液，5,000 rpm离心10分钟，去除上清。 往细菌沉淀中加入6 mL溶液A（含RNase A），充分振荡悬浮。注意：充分重悬细胞沉淀（无块状物）对于获得高的质粒产量十分重要。 加入6 mL 溶液B，温和翻转10 余次至透明。若混合液不透明，应减少细菌的用量或室温放置5-10分钟直到裂解液变透明。注意：避免剧烈振荡，否则细菌基因组DNA将断裂为小片段，与质粒难以分离，污染质粒DNA。 加入冰浴的8 mL溶液C，颠倒混匀，冰上放置10分钟。混合物中将有白色絮状物形成。注意不要过分振荡。 6,000 rpm离心10分钟。如果离心管承受能力强，离心速度还可以适当提高以充分沉淀絮状物。 将上清液（约20 mL左右）转移到离心过滤柱中（可以装20 mL左右），放入50 mL尖底收集管中。如果上清液较多，不能一次上完，可以分两次处理。 6,000 rpm离心5-10 分钟，离心过滤柱将吸附溶液中的基因组DNA 和杂质，而质粒DNA将在穿透液中。注意：转速不能过高，否则杂质会穿透过滤柱，污染质粒DNA。 将上步得到的穿透液移入到离心吸附柱中，放入50 mL尖底收集管中。 6,000 rpm离心5 分钟，质粒DNA将与离心吸附柱中的膜结合。弃穿透液。 将10mL通用预洗液加入到离心吸附柱中，室温静置2分钟后6,000 rpm 离心5分钟，弃穿透液。 将10mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静置2分钟后6,000 rpm 离心5分钟，弃穿透液。 重复上步一次。 室温6,000 rpm空甩5分钟，弃穿透液。注意：此步很重要，不能跳过。 将离心吸附柱放入一个干净的50 mL塑料离心管中，加1 mL通用洗脱液（洗脱液如加热到50-65℃效果更佳），室温静置2分钟后6,000rpm 离心5分钟，收集液即是质粒DNA溶液。 重复上步1次以便洗脱更多的质粒DNA。 合并所得质粒DNA，立即使用或-20℃储存。 疑难解答 可能出现的问题 可能原因 建议解决方法 琼脂糖凝胶上可见RNA帶 RNA降解不彻底 适当补加点RNase到溶液A中 产物中有大分子量的DNA污染 加入溶液B后有剧烈震荡或裂解时间过长 加入溶液B后不要猛烈振荡或搖匀，可轻轻颠倒离心管6-8次使充分混匀,并且时间一般在5分钟之内。 在琼脂糖凝胶上点样时，质粒漂出点样孔 洗脱步骤后，乙醇没有完全从柱子上去除 DNA洗脱前离心柱必须干甩一次。 DNA产量低 菌体量过多 细菌裂解率低 只使用含有氨苄青霉素的LB或YT培养基.使用时，不要使用超过4 mL的高拷贝质粒培养物或8 mL低拷贝质粒培养物(一般用过夜培养物1.5 mL)。 在加入溶液A后细胞没有充分混匀，可漩渦振荡悬浮液使之充分混匀。 加入溶液B后，延长裂解时间,使裂解液澄清即可,一般不会超过5分钟。 如果溶液B没有盖紧，可能需要重配.可按以下准备：0.2N NaOH，1% SDS。 使用的是低拷贝数质粒 若5 mL过夜培养物的产量小于0.5 μg，增加培养物的体积至10 ml. 注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途