实验一 生物化学实验基本操作及蛋白质.pptVIP

实验一 生物化学实验基本操作及蛋白质的定量测定 （双缩脲法） 一、实验目的 掌握： 1.生物化学实验基本操作； 2.分光光度法的基本原理及分光光度计的使用； 3.双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法 熟悉：标准曲线的绘制及其应用 二、教学内容 （一） 生物化学实验的基本操作和技术 1、实验室的基本规则。 2、实验中常见的玻璃器皿的使用和洗涤。 3、分光分析原理和分光光度计的使用。 （二）蛋白质的定量测定（双缩脲法） 1、实验原理 2、操作步骤 （1）标准曲线的制作： （2）利用分光光度计测定反应的吸光度。 （3）查标准曲线的蛋白质的含量。 3、实验结果和分析 生物化学实验的基本操作 1. 玻璃仪器的洗涤和干燥 2. 吸量管的使用及干燥 3. 液体的混匀 4.分光光度计的使用 2. Beer定律 ：以溶液介质浓度变化代替溶液介质厚度的改变，光能的吸收与浓度改变有类同的关系，即一束单色光通过溶液介质时，光能被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液介质浓度有一定的比例关系。 A=KC 将Lambent氏定律和Beer氏定律合并 朗伯—比尔定律 : A=KCL 双缩脲法测定蛋白质含量的原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)与硫酸铜作用形成紫红色的络合物，这个反应称为双缩脲反应。 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。蛋白质含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物（图1-3），且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10~120g/L范围内有良好的线性关系，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。 双缩脲法测定蛋白质含量的操作 1. 标准曲线的绘制 结果与分析 记录测定管吸光度A，通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，进而求算出标本的总蛋白浓度。 * 分光分析原理 朗伯—比尔(Lambert—Beer)定律 ： 1.Lambert定律 ： 一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系。 A=KL L A=KL A540 充分混匀，测定 λ=540nm吸光度。空白管调零，记录各管吸光度A 2 2 2 2 2 2 2 碱性CuSO4试剂（双缩脲试剂） - 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.9%NaCl溶液 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0 相当于血清蛋白的浓度 (mg/ml) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 - 蛋白质标准溶液（0.5mg/ml） S6 S5 S4 S3 S2 S1 O（空白管） 加入物(ml) A540 充分混匀，测定 λ=540nm吸光度。以空白管调零，记录测定管吸光度A 2.0 2.0 碱性CuSO4试剂（双缩脲试剂） - 3.0 0.9%NaCl溶液 3.0 - 100倍稀释血清 测定管（U） 空白管（O） 加入物（ml） 2. 测定未知样品蛋白质含量 *