遗传标记技术下技术介绍.pptVIP

TILLING技术 TILLING：Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (定向诱导基因组局部突变技术)，是一种全新的反向遗传学研究方法。该技术是基于人为的化学诱变产生突变位点，然后将这些突变位点转化为可以遗传的位点，最终利用检测突变位点的技术筛选出带有突变位点的个体，从而达到可以利用这些突变位点分析基因功能的目的。该项技术可以通过建Pool进行高通量样本的筛选。 技术路线：诱导产生突变体，多个样品建Pool 设计荧光染料标记的引物进行PCR PCR产物退火产生错配CEL-I酶切 电泳 成像 数据分析 美国国家科学基金会植物基因组计划（NSF Plant Genome Research Program (PGRP)）近年来大力发展高通量TILLING，并直接推动了以美国为首的北美实验室联合启动拟南芥 TILLING项目（ATP：Arabidopsis TILLING Project）。该项目组使用 LI-COR DNA 分析系统在其成立的第一年就为拟南芥研究者们提供了100多个基因上的1000多个突变位点。 实验流程 1　对拟南芥种子进行诱导处理产生一系列点突变2　将种子培养，获得第一代拟南芥突变个体3　第一代植株自花授粉，产生第二代4　将第二代植株种子收集，抽提DNA，存放于96孔板5　将多个96孔板的样本合并到1个96孔板内（最多可合并8个），用两对特异性引物进行PCR扩增，两对引物分别用700nm和800nm荧光染料标记。 实验流程 6　分别得到700nm和800nm两张图。发生突变的泳道，在700nm的图上可以在野生型条带下方看到一个条带，同时在800nm的图上相同的泳道也会有一个条带，这两个条带就是CEL I核酸酶的剪切产物，两个条带片断大小之和等于扩增片段的大小，从而很容易对扩增产物进行突变检测7　当混合样本检测到突变后，要对混合样本中的每个DNA样本再次进行筛选，检测出发生突变的DNA样本。 TILLING 流程 样品诱变处理 产生第一代突变个体 产生第二代突变个体 抽提DNA放入96孔板 8个样品混合入一个孔，进行特异性扩增 变性/退火产生异源突变体双链 CEL1 切开异源双链 Pool 收集 自花授粉 培养 变性后进行4300分析 检测到突变后，对混合样品中的每一个进行筛选,以确定对应的个体 检测 技术要点 技术要点一：获得高质量的TILLING图像　　将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后，可以同时获得两张真实的电泳图像（700nm和800nm）。应用TILLING技术时，获得未经修改的图像原始数据对于检测的灵敏度和准确性都很重要。如果检测系统在检测时对荧光数据已经进行了处理，很可能会过滤掉大部分甚至是全部的突变信息。 技术要点 技术要点二：双色成像能有效排除假阳性突变　　通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断。由于两个剪切片断采用不同的荧光染料标记，如果真的发生了突变，双色检测时将在野生型条带下面出现两个突变条带，分别位于700nm和800nm电泳图的同一泳道。同时，这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量，因而双色检测能够有效排除假阳性点突变，准确度很高。 技术要点 技术要点之三：高灵敏度的红外检测　　由于核酸外切酶活性会导致一些信号丢失，应用红外检测技术提高灵敏度对于TILLING检测非常重要。红外荧光检测相对可见光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外，结合红外荧光染料后，该检测方法还具有另一个优点——宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨，当野生型条带的信号强，突变型条带信号弱时，LI-COR DNA分析系统也能够轻松识别突变。 技术要点 技术要点之四：突变定位 ????成像程序可以识别存在突变样品位点的泳道并????估算条带的分子量，进行突变位点的定位分析。 高通量 高通量的突变筛选　　结合4300分析系统，TILLING作为一种高通量的筛选技术，其通量可达到：?? 每胶96个泳道，每次上样最多是8个混合样品，每天最多跑三次，这样96x8x3＝2304个/样品 TILLING 使用 licor 4300的优点 特性 优点 宽广动力学范围 高的信噪比 高灵敏度 可检出微弱的突变 原始电泳图 防止丢失突变 高质量 提供高品质的技术平台 双色检测 防止假阳性 改良的TILLING技术 改良： 无需荧光染料标记引物 无需特殊的荧光信号检测仪器 优势： 节省实验的成本和引物定制的时间 快速完成高通量的检