实验流程Western Blot精编.docVIP

浙江省中医院 排版 次 蛋白SDS电泳及Western Blot印迹技术 审阅人： 共 页 概述 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋白质分析过程中最常用的技术，通常在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS，SDS将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子；同时，由于SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。因此，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白质分子的大小。因此利用SDS可测定蛋白质的分子量。 Western blot是指利用SDS电泳，将各种蛋白质分离开后，通过电泳转移印迹到固相硝酸纤维素膜上，然后利用特异性抗体进行酶联免疫反应（ELISA），它具有特异性高，灵敏度好等优点。固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 Western Blot所用的酶主要为碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）。用AP标记的第二抗体可检测出10-15 pg的抗原；用HRP标记的第二抗体可检测出0.5-1.0 μg的抗原。 主要试剂的配制 1.0 mol/L Tris·HCl（pH 6.8和7.5）： Tris (三羟甲基氨基甲烷，MW 121.14)