RNA合成技术 培训.pptVIP

36.1 基因转录需要DNA依赖性的RNA聚合酶 36.2 RNA合成涉及三个过程：起始，延伸和终止 36.3 一些抗生素是RNA合成的抑制剂。 36.4 初始RNA转录物都需经转录后加工 36.5 核酶是个位置特异的核酸内切酶 36.6 基因转录调控－操纵子模型;RNA合成示意图;36.1 基因转录需要DNA依赖性的RNA聚合酶 大肠杆菌RNA聚合酶的核心酶是由5个蛋白亚基组成的，分别被命名为?，?ˊ，?（2个），和?亚基。其中?亚基是催化亚基，核心酶的分子量大约是350000。 大肠杆菌RNA聚合酶全酶还含有第六个亚基，称之?亚基（分子量为70000），与核心的RNA聚合酶瞬时结合，其功能是识别模板上的启动子，使RNA聚合酶与启动子结合。一旦延伸开始?亚基就脱离聚合酶。; 真核生物存在着三种不同的RNA聚合酶：RNA聚合酶I（RNA pol I）、RNA聚合酶II（RNA pol II）和RNA聚合酶III（RNA pol III）。每一种聚合酶都含有很多亚基，它们承担的任务各不相同。;（b）链延伸是一个核苷酰基转移反应 RNA聚合酶催化链沿着5ˊ至3ˊ方向延伸。链延伸所需的下一个核苷三磷酸经聚合酶验证与模板上相应的未配对的核苷酸正确地形成氢键，然后RNA聚合酶催化延伸着的RNA链的3ˊ-羟基对新进来的核苷三磷酸的α-磷进行亲核攻击，这一核苷酸基转移反应的结果是一个新的磷酸二酯键的形成和释放出焦磷酸，焦磷酸水解为无机磷酸释放能量保证了反应的进行。 当开始延伸后，?亚基立刻从 RNA聚合酶上脱落。随着RNA的延伸，已合成的RNA链离开模板，原来解旋的DNA又恢复双螺旋。DNA双链解旋时会使延伸泡前面产生扭曲应力，拓扑异构酶会防止扭曲应力的净增加。; RNA聚合酶 催化的延伸反应;转录延伸;（c）转录终止在特殊的终止子序列 在大肠杆菌中存在着两种终止机制，一种是蛋白依赖性的链终止，即一个终止蛋白?与RNA聚合酶复合体相互作用恰好终止在一个发卡环处，发卡环是在新合成的转录链上形成的。 蛋白?是一个ATP依赖性的RNA-DNA解旋酶，其功能是破坏了RNA-DNA杂化体，导致延伸复合体的解离，使合成的RNA链释放出来。 ;蛋白依赖性的链终止; 另一种是蛋白非依赖性的终止???用，其特征是也有一个类似的发卡结构，发卡下游处的模板链上恰好存在一串腺苷酸，对应的转录链应是一串尿苷酸。 所以转录终止也许是当延伸复合体停止在发卡结构处时，使得A-U配对碱基的RNA-DNA杂化体不稳定，导致复合体的解体而终止转录。;蛋白依赖性转录终止;36.3 一些抗生素是RNA合成的抑制剂 放线菌素D来自链霉菌，可以嵌入双链DNA中。放线菌素D中的吩恶嗪酮环插入到相邻的G-C碱基对之间，结构中的环状多肽占据了DNA双螺旋的空间，阻塞了转录的延伸。即使在很低的浓度下，放线菌素D都能有效地抑制原核生物和真核生物转录的延伸过程。 利福霉素是另一个非常有用的抗生素，也是从链霉菌分离出来的。利福霉素通过直接与细菌中的RNA聚合酶的?亚基结合来抑制RNA合成，特异地抑制第一个磷酸二酯键的形成。由于利福霉素不抑制真核生物的RNA聚合酶，所以一个合成的利福霉素衍生物利福平已用作为临床的抗结核菌药。; 放线菌素 D;36.4 初始 RNA 转录产物都需经转录后加工 1、初始mRNA转录产物的加工 初始mRNA转录产物要经过在其5ˊ端加一个甲基化的“帽子”和在3ˊ端加上一个多聚腺苷酸的尾巴，并且要切去内含子，将外显子拼接在一起构成一个功能性的mRNA。 大多数真核生物中编码蛋白质的基因是由编码蛋白质氨基酸序列的外显子和散布在外显子中非编码序列的内含子构成的，即外显子被非编码序列内含子隔开，所以真核生物基因又称之为断裂基因。刚转录出的RNA产物，也称为非均一RNA（hnRNA）必须通过一种称之RNA剪接机制进行加工。 细菌基因的编码序列是连续的，转录后的mRNA不需加工就可直接作为模板翻译蛋白质。;通过成熟RNA-DNA杂交给出了鸡卵清蛋白的非编码序列（内含子）; 真核生物mRNA的5ˊ端有一个“帽子”结构，是由稀有的7-甲基鸟嘌呤通过5ˊ,5ˊ－三磷酸键与初始转录物的起始（ 5ˊ ）核苷酸连接形成的。这个帽子是在转录到20个核苷酸时在转鸟嘌呤核苷酸酶催化下加到5ˊ端的。 mRNA上的5ˊ帽子对于蛋白质合成的起始是很重要的，同时它可保护mRNA转录本不被核酸外切酶降解。;