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DNA提取与基因克隆 引言 DNA 为英文Deoxyribonucleic acid的缩写 又称脱氧核糖核酸 是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。 引言 DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如达蛋白质与RNA所需。带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。 DNA的基本理化性质： DNA是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离酸易溶于水，DNA钠盐在水中溶解度为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。 样品来源 理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA 样本选择取决于试验目的 全血是基因组提取最常见的样本 血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上 血浆和血清 血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测中 血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质的混合物 它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景 血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分 体液 尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后取沉淀提取体液中细胞的核酸 对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸 分泌物 （以痰液为例） 痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细胞和唾液等影响检测结果 结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液 痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率 DNA提取前样本采集、预处理和保存： 全血 1.抗凝剂 EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素 DNA提取原理 利用核酸在不同溶液中溶解度的不同从而进行分离的方法。 DNA提取基本步骤 样品裂解 核酸纯化 DNA提取的基本步骤 1、核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应最广泛的方法） 2、核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离,非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液. 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后 使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤 样品裂解 使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程 。 了解你的样本 真核生物DNA、细菌DNA、病毒DNA、质粒DNA 细胞悬液DNA、组织DNA 分离纯化核酸总的原则： 1. 保证核酸一级结构的完整性； 2. 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；排除其它分子的污染。 样品裂解 ①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使