中国药科大学中药分析技术课件-生物大分子分析.pptVIP

生物大分子分析 刘 吉 华 什么是生物大分子？ 生物大分子主要是指蛋白质（多肽，酶）多糖和核酸。他们是生命现象的基本体现者。 许多生物大分子都具有一定的生物和药理活性，在医药卫生、科学研究等方面有着广泛的应用。 怎样进行生物大分子分析 大分子的分离纯化 大分子的含量测定 大分子结构分析 大分子活性分析 分析前我该做些什么呢？？？ 进行充分的调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定的了解，然后着手进行实验工作。 未知的生物大分子？？？ 试样进行创造性的分离纯化时，首先要明确研究的主要目的。如分离纯化肽类物质或酶类等，可参考已有的肽类或酶类物质分离纯化方法进行反复的摸索比较，找到规律，逐步达到预期的目的。 怎么知道我的程序是对的？ 建立相应的分析鉴定方法及生物活性检测方法。即对目的活性物质的跟踪性分析，以便正确指导分离纯化工作的深入进行，若要提纯某一生物大分子达到一定的纯度，一般要经过多种方法、步骤和不断变化操作条件才能达到目的。因此，整个实验过程中，各种方法的优劣，所选条件的好坏，均须通过分析鉴定和生物活性测定来判断。 生物大分子制备的前处理 在一种生物材料中，可同时存在几十种至几百种的生物大分子，要制取某一种生物大分子，选材就很重要。应从实验的目的来选取合适的生物材料。 从工业生产的角度选材，要注意选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物材料做原料；科研角度选材，只要符合研究的目的就可以。 应注意植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物的性别、年龄、营养状况、遗传素质、生理状态和微生物的菌种代数、培养基成分等之间的差异。 细胞破碎和提取 生物大分子多数存在于细胞内部，分离提取某一大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态、不丢失生物活性。 根据不同的情况，选择适当的方法将组织和细胞破碎，破碎程度越高，目的物的产量越高。材料中被制备物质的存在形式及部位于组织破碎及抽提的方法有直接关系，必须在实验前有所了解。细胞内含物不论存在于何种部位都必须采取不同方法进行破碎 材料为提取液、体液（如血）、代谢排泄液（如尿液）、细胞外某些多肽或蛋白质、酶等则不需要破碎细胞。 组织细胞破碎常用方法 机械法 组织捣碎机：一种用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶、芽等材料组织细胞破碎的仪器。其捣碎最高转速可达每分钟1-2万转，由于旋转刀片的机械切力很大，制备一些较大分子如核酸等则很少使用。 匀浆器：匀浆器的研磨杆和玻璃管内壁之间的间隙常保持在十分之几毫米之间，细胞破碎的程度比组织捣碎机高，制作匀浆器的材料，除玻璃外，还有硬质塑料，不锈钢和人造荧光树脂等。 研磨：多用于细菌或其他坚硬植物组织。细菌磨是一种改良的研磨器，比一般研钵具有更大的研磨面积，而且底部有出口。 其他大型细胞磨碎器：如大型压榨器、匀浆器等，主要是在高压下使细胞通过小孔而被挤碎，适用于微生物发酵工业，目前也有利用相应原理制成的小型的实验室设备 物理法 反复冻融法：先将样品在-20℃冻固，再缓慢融化，反复多次可将大部分细胞破碎，此法多用于动物细胞材料 急热骤冷法：将样品材料投入沸水中，维持90℃左右数分钟后，置冰浴中急速冷却，使细胞壁结构受到破坏。此法常用于细菌及病毒材料，但制备对热敏感的物质时慎用 超声波处理：多用于微生物材料，频率一般选在10KC-20KC之间，功率在200-500 W范围，对于不同细胞，应视具体情况而定。处理时间数分钟至数十分钟不等。处理效果和样品浓度及适用功率有关，在处理过程中如温度过高应注意冷却。 化学和生物化学方法 自溶法：自溶法是在一定的pH和温度条件下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。自溶法需要较长的时间，常添加少量的防腐剂如甲苯、氯仿等防止细菌污染。 酶解法：利用各种水解酶和溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、几丁质酶和脂酶等专一性地将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。适于制备大分子核酸材料的破壁。 表面活性剂处理：如十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等均对细菌细胞壁有一定的破坏作用 生物大分子的提取 提取即是让被提取的生物大分子以溶解状态充分释放出来，并尽量保持原来的天然状态，不丢失生物活性的过程。 提取条件的选择，在考虑目的物溶解性的同时，应考虑物质在该溶剂、该pH条件下的稳定性。一般来讲，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性生物大分子易溶于碱性溶剂，碱性大分子物质易溶于酸性溶剂，温度升高时溶解度常增大，对于酶、蛋白质、多肽类在远离其等电点处的pH值溶解度增加，生物大分子提取时间越长溶解度越大，而同时杂质溶解度也增大。提取条件应综合分析各种