大鼠肝实质细胞质膜蛋白质组及敬钊缨毛蛛毒素组研究.pdfVIP

摘要 第一部分大鼠肝实质细胞质膜亚结构域的蛋白质组学研究 肝实质细胞是一种具有高度极性的细胞，其质膜可以分为三个不 同的形态和功能区域：1．与血窦Disse腔相对的区域(血窦面质膜， SPM)2。与相邻细胞表面形成胆管腔的区域(胆管面质膜，CPM)3． 外侧与相邻细胞连接的区域，其中部分形成连接复合体(细胞连接面 质膜，LPM)。正常质膜的极性对于肝实质细胞执行不同的功能具有十 分重要的作用，极性的失去将会导致很多疾病如胆汁淤积等。因此， 了解参与功能膜极性起源和维持的组成分子对于肝细胞生物学、肝脏 疾病的发病具有一定意义。 将新鲜分离的大鼠肝实质细胞匀浆后进行离心分离，在核的部分 得到两个亚结构域，在微粒体部分得到另一个亚结构域。通过形态学 分析和免疫印迹实验对这三个亚结构域进行区分验证。这些亚结构域 上的质膜蛋白质先通过1D-SDS—PAGE或16BAC／SDSD胶电泳技 术进行分离后再进行nano—LCESI-MS／MS分析鉴定。 在实验中，613个非冗余蛋白质被鉴定，其中32．3％含有跨膜区， 质含有至少一个跨膜区，包括唾液酸糖蛋白受体，表皮生长因子受 体。此外，也鉴定到一些已知定位在极性肝脏质膜区的蛋白质和新的 潜在的亚结构域特有蛋白质。我们的研究同时也证明了Na：C03水溶液 处理方法和两种基于胶的整合跨膜蛋白质的分离方法适用于质膜蛋 白质组学的研究。 关键词：肝实质细胞，质膜，亚结构域，极性，串联质谱 第二部分敬钊缨毛蛛毒素组学研究 jingzhao)是近年在中国海南省发现的 敬钊缨毛蛛(Chilobrachys 一蜘蛛新种，属于捕鸟蛛科，性凶猛，其毒液对小鼠具有致命性(IC50 为0．4mg／kg)。为了解敬钊缨毛蛛毒素的组成以及其致毒机理，而且 也为将来从中筛选有开发潜力的分子，我们采取蛋白质组学的方法对 敬钊缨毛蛛毒素进行了全面的分析。 为便于分析，我们采取分子筛层析首先将粗毒分为分子量10 kDa的蛋白质组份和分子量10kDa的多肽类组份。对于蛋白质组份， 我们采用二维双向凝胶电泳(2．DE)进行分离，获得90个蛋白质点， MS)以 经基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI．TOF．TOF MS)分析，结合 及液相电喷雾四级杆时间飞行质谱(LC．ESI．Q．TOF 常规Mascot搜库和MSBLAST搜索，总共鉴定了54个蛋白质点。 其中主要有各种酶类，高分子量毒素类，血蓝蛋白，以及未知蛋白等。 对于敬钊缨毛蛛毒素中的多肽类组份，采用阳离子交换色谱及反相高 多肽鉴定总计发现有超过120种多肽成分存在，其分子量主要集中 在2．8kDa，其中31种多肽获得其全序列，29种多肽得到其N端部 分序列。序列比对表明，大多数敬钊缨毛蛛毒素多肽与来源于其他捕 鸟蛛科的多肽毒素有较高的序列同源性，其中主要是各种电压门控钠 和钾离子通道的抑制剂以及昆虫专一性毒素。 本研究首次全面分析了敬钊缨毛蛛毒素的组成，揭示了蜘蛛毒素 种类及功能的复杂性和多样性，为深入研究敬钊缨毛蛛毒素的组成， 进化，以及毒素分子结构与功能的关系奠定了基础。 关键词：敬钊缨毛蛛，双向凝胶电泳，质谱，高效液相色谱 Ⅱ ABSTRACT Part on6：Proteomicof Subfractions analysisplasma-membrane fromisolatedrat hepatocytes are cellswiththeir membrane Hepatocytehighlypolarized plasma inthreedifferent an