大菱鲆Scophthalmus maximus肝细胞体外培养、红体病虹彩病毒体外繁殖条件及病毒疫苗研制的研究.pdfVIP

大菱鲆(Scophthalmusm锨砌螂)肝细胞体外培养、红体 病虹彩病毒体外繁殖条件及病毒疫苗研制的研究 摘要 大菱鲆(Scophthalmus 宝鱼”，是重要的海水经济增养殖鱼类之一。近年来，由于环境污染的日益加剧 和养殖业的过度膨胀，各种传染性疾病尤其是病毒病开始广泛传播，病毒性疾病 危害最大，并且极难防治。大菱鲆红体病是近年来对大菱鲆养殖业危害较大的一 rddish iridovirus， 种病毒性疾病，其病原为大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbotbody TRBIV)。大菱鲆死亡率逐年上升，。给大菱鲆养殖业带来了巨大的经济损失。从 根本上解决和预防大菱鲆病毒病的关键是要查清病毒的感染途径、感染机理以及 研制病毒疫苗对大菱鲆进行免疫预防，而建立新的大菱鲆细胞系是进行病毒研究 的理想体外研究体系和制备病毒疫苗的有效方法。 本文采用胰蛋白酶、透明质酸酶和II型胶原酶消化法成功启动了大菱鲆肝组 织的原代培养，原代培养启动一周后，组织块周围即有大量的细胞迁出，形成明 显的生长晕，30天后便可长成细胞单层。通过比较DMEM／F一12和L．15两种培养 液，发现DMEM／F一12更适合大菱鲆肝细胞的体外培养。确定了大菱鲆肝细胞的 N一 ng／mL碱性成纤维细胞生 乙酰葡萄糖盐酸盐、10ng／mL表皮生长因子(EGF)、10 32代。 effects，CPE)，是病毒 病毒感染体外培养细胞引起的细胞病变效应(cytopathic 在细胞内增殖的一个重要检测指标。本文利用TRBIV的敏感性细胞牙鲆腮细胞 (Flounder 行了鉴定，并测定其血凝效价作为病毒含量的标准，同时进行了体外最适繁殖条 件如病毒接种量，吸附时间及细胞培养条件等的研究。结果表明，病毒接种量、 病毒吸附时间、细胞培养条件均对TRBIV的体外繁殖产生明显的影响，如下繁殖 条件可使病毒的繁殖速度最快：0．2mL病毒液(血凝效价为1：64)接种于FG细 胞，进行2h吸附后补加10％胎牛血清．MEM培养液，置220C培养。另外还发 现，病毒的感染力均受到病毒的收获时间和病毒液冻融次数的显著影响，在最佳 繁殖条件下，收获在细胞中繁殖至第4天的病毒，且只冻融1次，可使其保持最 强的感染活力，反复冻融会使病毒的感染活力显著降低。TRBW的繁殖及其收获 条件的确定，为后续大菱鲆病毒疫苗的研制奠定了基础。 在TRBIV的体外最适繁殖条件下，对TRBIV进行了大量增殖，利用传统的 甲醛灭活法制备TRBIV灭活疫苗，加入终浓度为O．1％福尔马林，于37℃进行灭 活处理48小时，即获得灭活TRBW疫苗原液，置4℃保存，待使用时再行稀释 TRBW疫苗的安全性检测结果显示，灭活TRBIV疫苗液不会引起FG细胞病变， 也不会造成健康正常大菱鲆染病，证明所得病毒疫苗已被有效灭活，具有高度安 全性，可用于大菱鲆的预防免疫。TRBW疫苗对大菱鲆的免疫保护力检测结果证 明，实验室内注射灭活TRBIV疫苗对lO尾大菱鲆的免疫保护率为90％，养殖场 内浸泡灭活TRBW疫苗对两个养殖场中50万尾和200万尾大菱鲆的免疫保护率 分别为83％和85％，证明所得灭活TRBIV疫苗对大菱鲆具有极高的免疫保护率； 血清抗体检测结果显示，TRBIV疫苗接种8天后，大菱鲆体内血清的血凝抑制效 抗TRBIV感染的免疫力。 彩病毒；病毒疫苗 lI Studiesonihv／trocultureoflivercellsfrom turbot, ot 刀列D潮 onof‘oIturb‘reddishb Scophtha／mus朋扭矗m14S,propagafion