大肠杆菌中5氨基酮戊酸合酶（ALAS）系列新型融合表达载体的构建、表达及纯化.pdfVIP

摘 要 5一氨基酮戊酸合酶(5-Aminolevulinic acid，ALAS)存在于所有的生物体内，是 c4途径中血红素合成代谢的限速酶，催化琥珀酰辅酶A和甘氨酸缩合成ALA，CoA和 CO,。ALA是合成卟啉、血红素、叶绿素、维生素B12等四毗咯化合物的代谢中间体， 在农业生产中具有广泛的应用，不仅可作为除草剂、杀虫荆，还可提亵植物的抗盐、 抗冷冻能力，这对于缓解生态环境恶化，提高农业生产水平具有重要的现实意义。 此外，5一氨基酮戊酸也被广泛用于肿瘤的症断及癌症的治疗方面。目前，由于不易 获得大量天然ALAS而阻碍对其结构与功能的研究。本实验为了获得天然蛋白，构建 的三种载体分别转入BL21中进行诱导表达，经镍柱一步纯化可获得高纯度的ALAS ‘ 重组蛋白。本实验主要获得如下结果： 1．根据已公布的heml基因的全序列，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基 因组为模板．去除N端导肽序列的核苷酸序列，以编码Ash63为第一个氨基酸残 基，上游引物编码的起始氨基酸为Met，设计并合成引物，采用PCR扩增出一个 大小约为1．4—1．5 kb的特异DNA片段，进一步测序表明同已公布的酿酒酵母heml 基因片段的序列完全相同。 融合表达的蛋白在N端都具有六个组氨酸和三种最常用的具有增加可溶性表达的 标签(GST，加P，DHFR)，并且融合蛋白中具有TEV蛋白酶的切割位点。 可溶性表达且表达量有显著的提高。舳P／ALAS未能获得完整的融合蛋白，在MBP 与ALAS之间在胞内发生了断裂，推测可能的原因是MBP与ALAS连接的肽链过长 叠和增加其可溶性表达 分析表明纯化都为均一的一条带。表明利用His—Tag筛选和纯化目的蛋白是一种 快速而有效的方法 综上所述，本文已成功地从酿酒酵母基因组克隆出编码成熟5一氨基酮戊酸合酶的 得了ALAS在大肠杆菌中的高效重组表达重组蛋白，并纯化至均一，为ALAS晶体结构 解析及酶催化机理和功能的研究提供了基础。同时三种高效原核融合表达载体： pET-HMA，pET—HGA和pET-HAD为蛋白质在原核系统的高效表达提供了平台。 关键词；重组蛋白 5一氨基酮戊酸合酶融合表达麦芽糖结合蛋白谷胱苷肽转移 酶二氢叶酸还原酶 Abstract acid inall 5-aminolevulinie synthase(5-Aminolevulinicacid．ALAS)exists isthe ofheme inC4 and catalyze organisms,whichkeyenzyme synthesispathway Aand and ismetabolic glycinesynthesizing姒CoAC02．ALA succinyl-coenzyme intermediates and h蠡broaded synthesizing B12 home，chlorophyll，vitamintetrapyr，which in isnot usedas and applicationagriculturalproduction．It