大腹圆蛛基因组DNA文库构建及其拖丝蛋白基因的杂交筛选.pdfVIP

大腹圆蛛基因组DNA文库构建及其拖丝蛋白基因的杂交筛选 摘要 蜘蛛属节肢动物门(彳帅D出)，是蛛形纲(彳，口c砌。胁口)中最大的一 类，约36000种，我国已记录蜘蛛2361种。所有蜘蛛都能纺丝，蜘蛛丝是天 然丝纤维中最细的丝，具有特殊的结构，在许多方面都表现出独特的优良品 质，如强度大、弹性好、韧性强、耐冲击、耐疲劳，而且密度低、抗辐射， 具有可湿性、耐火、耐热、耐低温，无论是在干燥状态还是潮湿状态都表现 出很好的性能：由于蜘蛛丝是由蛋白质构成，具有生物可降解性，是可循环 再生的材料，因而对环境是友好的。 由于蜘蛛具有同类相食的特性，难以密集饲养，限制了蜘蛛丝蛋白的广 泛应用。因此，通过转基因技术大量获得蜘蛛丝已经成为当前生物学研究的 主要目标。在我国，分布最广、蛛丝性能极佳的当属大腹圆蛛(彳朋门P淞 vP肋一记os淞)，虽然已有一些科研人员对其进行了研究，但还没有得到拖丝蛋 白编码基因的全长序列。为了获得大腹圆蛛拖丝蛋白编码基因，本论文从以 下方面进行研究： 首先，通过大量的对比实验，建立了适合蜘蛛基因组DNA的提取方 法——尿素裂解法。该方法简单便捷，成本低，无需液氮研磨，可在常温下 进行，裂解过程中不形成沉淀，呈悬浮状，不用颠倒混匀，避免了流体剪切 力对高分子量DNA的剪切作用，完整性好，提取的DNA大小远在23kb以 上，更适合高分子量基因组DNA的提取；DNA得率高，每毫克蜘蛛附肢肌 肉可提取出150 ng左右的高分子量基因组DNA，无蛋白质污染，满足分子生 物学实验的要求。 将提取的基因组DNA随机断裂成约40kb的片段，经过末端补齐、5’端 磷酸化后，用琼脂糖凝胶分离、纯化，连入CopyControlpCC2FOSⅢ载体， Lambda EcD，f， 通过MaxPlaxTMPackagingExtracts包装，转入EPl300TM．T1R 成功构建了无偏向性、覆盖大腹圆蛛全部基因的Fosmid文库，其包装滴定度 达8．0×104。根据已经公布的蜘蛛拖丝基因特征序列，设计并合成了位于拖丝 蛋白N端、中间重复区和C端的特异性杂交引物，经【Q．32P】dCTP标记后进行 反复原位杂交。以中间重复区杂交引物重复杂交2次，在大约4．8×105个菌落 中筛选出约1．3×103个阳性克隆；再以C端特异性杂交引物对上述1．3×103个 阳性克隆进行杂交，得到82个清晰的阳性斑；最后，以N端特异性杂交引物 在上述结果中筛选出12个阳性克隆。从理论上讲，这12个阳性克隆应该含 有大腹圆蛛拖丝蛋白的全长编码基因，虽然杂交存在一定的假阳性，至少会 包含部分编码基因，其它阳性克隆也会含有拖丝蛋白的部分编码基因。用鸟 枪法随机测序，得到了4条具有典型拖丝蛋白重复序列(GAGA、GGX和 腹圆蛛丝蛋白基因有90％以上的序列同源性。 通过本论文的研究，建立了尿素裂解法提取蜘蛛基因组DNA，解决了蜘 蛛基因组DNA提取难题，成功构建了蜘蛛基因组DNAFosmid文库，获得了 携带大腹圆蛛拖丝蛋白编码基因的阳性克隆，得到了拖丝蛋白编码基因新序 列，对进一步深入研究和开发蜘蛛丝打下了良好的基础。 关键词：大腹圆蛛，基因组DNA，拖丝蛋白基因，DNA提取， 基因组文库，杂交筛选 CONSTRUCTIONoFARANEUSVENTRICoUS SPIDER GENOMICDNALlBRARYANDSCREENING ITS DRAGLINESILKGENESWITHHYBRIDSYSTEM ABSTRACT isthe member Spider largest in时achnoide如ChelicarataAnhropoda．There are of 1“nds、Ⅳererecordedin approximately36，000妯ndsspiders，ofwmch，2，36 our bndsof can tllat