免疫组织化学教案(精品)幻灯片课件.pptVIP

(1)特异性与亲和力: 特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。免疫动物早期获得的抗血清特异性较好，但亲和力低;后期获得的抗血清一般亲和力较高，但长期免疫易使免疫血清中抗体的类型和反应性变得更为复杂。因此，用于诊断的试剂必须尽量选用特异性高、亲和力强的抗体，才能保证和提高试验结果的可靠性。 （2）浓度: 抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合适的浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行抗体预滴定，找出最适反应浓度。 二、环境条件 l、酸碱度 合适的pH是抗原抗体反应的必要条件之一。血清学试验一般以pH6-9为宜，超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质，导致假阳性或假阴性结果。当pH为3左右时，接近细菌抗原的等电点，可出现非特异性酸凝集，造成假象。 2、温度 抗原抗体反应一般在15一40℃范围内均可进行，最适温度为37℃。在此范围内温度越高，分子运动速度加快，增加抗原抗体接触机会，反应速度越快，但亦容易引起复合物解离;温度越低，反应速度缓慢，但抗原抗体结合牢固，易于观察。某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度，如冷凝集素在4℃时与红细胞结合，20℃以上反而解离。 3、作用时间 抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。 此外，抗原抗体反应在液相中反应时，适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。 必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 免疫组织化学的标记 常用标记物 ① 荧光素：在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受到激发光的照射而发出明亮的荧光（绿色、蓝色、红色等）。 免疫组织化学的标记物 正常大鼠脊髓前角神经元 488标记 200× 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点。 正常大鼠脊髓 CGRP 辣根过氧化物酶标记 200× ③ 生物素：（Biotin） 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用） 免疫组织化学技术染色方法 1．直接法 荧光素直接标记特异性抗体（—抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→检测抗原。 △ 酶标抗体要显示后镜检。 优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。应用：基本不用了！！ 2．间接法 标记物标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。※显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→鉴定多种抗原。 抗 原 一抗 抗 原 一抗 二抗 抗 原 一抗 二抗 3．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法）~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗 原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。 4．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC法） Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨 大，牢不可破。 ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。 5．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色） 6．蛋白A—金法（Protein—A gold method）：多用于电镜 7．双重组化染色法：应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。 具体步骤及注意事项(冰冻切片为例) (一) 灌注固定后取材及处理 左心室插管，将右心耳剪开，首先用0.1M PBS缓冲液冲洗，至液体变清（用量视动物大小具体而定，大鼠一般为250ml，猫为500ml），然后换4%多聚甲醛（0.1M PBS缓冲液配制，用量视动物大小具体而定，大鼠一般为200ml即可，猫为500ml） 固定的目的: (1)能迅速阻止死后变化,防止组织的自溶与腐败。 (2)使细胞内物质（如蛋白质、脂