极端嗜热古菌—硫化叶菌拓扑异构酶的研究.pdfVIP

摘要 生长pH为3左右，基因组DNA被认为呈松弛状态或略带正超螺旋。本文通过 Q 解的能量在低盐浓度下(10mMNaCI)向DNA分予中引入正超螺旋。N一末端 序列及同源性搜索发现，该酶的编码基因为topRl，而非先前从该菌中克隆得 到的topR基因。 拓扑异构酶I是在细菌、古菌和真核生物中普遍存在的一种拓扑异构酶。已 完成全序列测定的硫磺矿硫化叶菌(ssolfataricus)编码一个推测的拓扑异构 I)。本文克隆并在大肠杆菌中表达了编码SsoI的基因，采用 酶I(SsoTopo Topo 一个包括热处理的简单纯化程序纯化了重组蛋白。活性分析表明，重组蛋白能 1 够松弛负超螺旋DNA，因此是拓扑异构酶I。定点突变实验证实38位的酪氨 酸是该酶的活性位点，突变酶(Y318F)完全丧失了负超螺旋松弛活性和寡核 苷酸切割能力。Sso I不能松弛正超螺旋DNA，其负超螺旋DNA松弛活性 Topo 7．5—9．0，最适反应温度为75℃，该酶具有较高的热稳定性，85。C保温3小时 后，酶活只是略有降低。该酶的作用模式受盐浓度的影响，在低盐浓度下(50raM) 为行进式，而在高盐浓度下(200n[IM)为分布式。在标准的实验条件下，该酶表 现出很高的负超螺旋松弛活性，40fmol的酶在30分钟内就可以完全松弛300ng I有抑制作用的化学物质一亚精胺，可 负超螺旋pUCl8质粒。对大肠杆菌Topo 明显促进该酶的活性。 Sso I具有对含有特异切割序列的单链寡核苷酸的切割活性，该酶的特 Topo l 异性切割序列为G(A／T)CA(T)AG(T)G(A)Xxx。切割模板的长度对该酶的切割 活性有很大影响，切割模板在切割位点的5’端至少要有8个碱基，3’端至少要 I的切割活性依赖于二价阳离子的存在，在试过的阳离子 有2个碱基。SsDTopo 2+等均可支持切割，该酶的切割活性受 中，Mg”，Ca+，Cu”，Co”，Mn2+和Ni 温度影响，当温度低于37C时，活性明显减弱。 本文首次对古菌的拓扑异构酶I进行了较为详细的研究a Abstract at80C．The archaeon，lives shibatae，a optimally Sulfolobus hyperthermophic toberelaxedor DNAisbelieved supercoiled．Amajor genomic sli曲tlypositively reverse was to from shibatae a by Sulfolobus using homogeneity gyrasepurified novel on and hepa