枸杞类胡萝卜素合成酶基因（PSY、LycB）的克隆及其转化洋桔梗的研究.pdfVIP

摘 要 类胡萝b素具有许多重要的生物学功能。在植物中，类胡萝h素是光合作用的 辅助色素，为光合作用捕获光能；另一方面，它们在高温强光下能通过叶黄素循环 耗散过剩的能量，保护叶绿素免受高温强光的破坏；同时也赋予了植物花朵果实鲜 艳的色彩，具有重要的农艺价值。在保护人类健康方面，类胡萝卜素起着更重要的 作用，约有10％的类胡萝卜素是维生素A的前体。因此利用基因工程手段调控植物 体内类胡萝卜素的代谢和积累，改良果蔬品质、改变花色，倍受到人们关注。 枸杞是我国传统中药，富含类胡萝b素。目前还未见有关枸杞类胡萝b素合成 关键酶基因克隆方面的报道。因此本论文以枸杞为试验材料，进行枸杞类胡萝卜素 合成关键酶基因(PSY．上ycB)的分离，为应用基因工程技术改变植物体内类胡萝b 素成份和提高类胡萝b素含量提供基因资源。 洋桔梗是目前国际上十分流行的盆花和鲜切花之一，具有较高的经济价值和观 赏价值。通过转基因技术来改变花色，是一种较常规技术更为有效、快速的方法， 是现代生物技术在花卉育种中的具体应用。 本研究构建了枸杞叶片eDNA文库，利用同源序列法从枸杞叶片eDNA文库中 植物表达载体，并建立了洋桔梗叶片体外再生体系，利用农杆菌介导法将PSY基因 导入洋桔梗，获得以下结果。 重组效率为88．1％。 2、参照其它植物的船KLycB基因序列设计引物，采用PCR技术从枸杞叶片 基因eDNA全长l 292bp，阅读框位于7~l284bp之间，共编码425个氨基酸。船y eDNA核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物的同源性分别为75％～80％和 541 bp，编 码508个氨基酸，核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物的同源性分别达78％ 对PSY、LycB基因所编码的蛋白质的基本特性、氨基酸组成以及二级结构进行了分 析。 用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中。 Blue)叶片体外再生体系．洋桔梗叶片不定芽诱导培养 4、建立了洋桔梗(Deep 基为MS+6-BA1．0mg／L+NAA O．5mg／L。 O．5mg／L+GA3O．6mg／L，不定芽生根培养基为I／2MS+IBA 化的影响。确定脱菌培养基中用300mg／L的头孢霉素(Cef)来抑制农杆菌的生长。 6、研究了卡那霉素(Km)对洋桔梗叶片分化、不定芽生根的影响。确定不定 度为15mg／L。 7、以PSY基因为目的基因，通过农杆菌介导法进行洋桔梗的遗传转化。建立了 洋桔梗的遗传转化体系，适宜的农杆菌菌液浓度OD,soo值为0．6，侵染时间10rain， 共培养时间3d，乙酰丁香酮(AS)的添加浓度以100pmoFL为宜。 株的PSY基因双位点插入到洋桔梗基因组中，有l株PSY基因单位点整合到洋桔梗 基因组中。 关键词：类胡萝卜素；枸杞：eDNA文库；八氢番茄红素合成酶基因；番茄红素B． 环化酶基因；洋桔梗；转化 Abstract Carotenoidshavea ofdiverse areessential range biologicalfunctions．They of membranesin as of componentsphotosynthetic plants，functioncopigments and alsofunctionin offlowersand photosynthesisphotoproteetant．Theypigmentation in fruits．Carotenoidsan