枯草芽孢杆菌224 yplQ、ytjAa基因缺失菌株的构建及对其溶血性影响.pdfVIP

摘要 摘要 subtilis 枯草芽孢杆菌224(Bacillus224，BS224)是一种从人体中分离出来的非致病性 芽孢杆菌，根据微生态学原理，利用微生物间的拮抗作用，由其活菌体制成的生物制品白天 鹅气雾荆是一种有效治疗烧伤创面感染、促进创面愈合的烧伤外用药，但由于具有溶血性能， 目前，已经停止了其在医疗方面的使用。 目前，国内外还没有枯草芽孢杆菌224基因组序列的相关报道，但枯草芽孢杆菌168基 为其中的两个，并且ytjAa为a溶血素样基因。 本实验是根据枯草芽孢杆菌168基因组序列设计引物，以枯草芽孢杆菌224染色体DNA 态中，并从含氨苄青霉素抗性平板上筛选出阳性克隆，对阳性重组子进行酶切鉴定和测序分 为99．8％、99．4％，因此可以确定枯草杆菌224的基因组中yplQ、ytjAa基因克隆正确。 和基因中的下游0．5kb的两段DNA序列作为打靶载体的同源长、短臂，将此两段序列按同一 ⅡI单酶切线性化后，电转化至枯草芽孢杆菌224感受态中，50∥g·IIlld新霉素抗性平板筛选。 利用PCR鉴定方法筛选yplQ基因缺失株，检测36个抗性转化子确定基因缺失株。 和上游约0．4kb的两段DNA序列作为打靶载体的同源长、短臂，将此两段序列按同一方向分 I、EcoR 质粒pMDl8．T-neo—ytjAa作为基因打靶载体。将构建好的舛jAa基因打靶载体用风f I双酶切线性化后，电转化至枯草芽孢杆菌224感受态中，50 ktg-m11新霉素抗性平板筛选。 利用PCR鉴定方法筛选ytjAa基因缺失株，检测12个抗性转化子确定基因缺火株。 将yplQ、ytjAa基冈缺欠株接种到5％的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测，结果这两个 基冈缺火株在血平板上仍能够引起溶血，说明单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体的ypiO、 ytjAa基冈对菌株的溶血性无影响或影响不大。 5个基因单独作用对其溶血性均 本实验是在已经确定yqhB，yrkA，yugS，yhdT，yhdP 无影响的基础上，对枯草芽孢杆菌224溶血样基因继续研究，利用同源重组法构建枯草芽孢 杆菌224yplQ、ytjAa基冈缺失株，并进行溶血性检测以确定溶血基因或引起溶血的主效基冈， 对枯草芽孢杆菌224溶血基冈的最终确定和溶血作用的研究迈出了关键的一步。 关键词枯草芽孢杆菌224：同源重组；溶血性；yplQ基因缺失；ytjAa基冈缺火 Abstract DelectedMutant Constructionof and in yplQytjAagene Bacillussubtilis224andInfluenceon Hemolysis Abstract Bacillussubtilis224wasa Bacillusthat fromhuman non．-pathogenic separated body．Accord．． tothe andthe the Swan ing Microecologyprinciple antagonismamongmicroorganism，White aerosolmadeoflive a BS224waseffectivemedicineforbumexternal couldtreatinfected