黄粉甲抗冻蛋白在毕赤酵母中的表达及抗冻活性研究.pdfVIP

摘要 抗冻蛋白是20世纪60年代首先从极地鱼血淋巴中分离的一种蛋白质，它可以抑制 冰晶的生长并以非依数形式降低溶液的冰点，不影响熔点，因而导致溶液的冰点与熔点 出现一差值。对抗冻蛋白的基础研究及其在生物技术应用领域的研究已经成为目前国际 上一个比较热门的研究方向。人们试图通过转基因方法使抗冻蛋白在原核生物中(如大 肠杆菌)表达，利用生物反应器来定向生产AFP。但是就目前的实验结果来看，抗冻蛋 白在原核生物体内往往不能被正确的加工而形成有活性的AFP，且用大肠杆菌表达的蛋 白以包涵体的形式存在，这样对后续的分析工作十分困难。故我们建立了以毕赤酵母为 宿主菌的表达系统。本实验拟通过毕赤酵母表达系统，利用毕赤酵母质粒pPIC9K中含 有的酿酒酵母基因组的a因子，有效地分泌表达出具有生物活性的抗冻蛋白1．mAFP， 为TmAFP的应用研究打下结实的基础，并在条件合适的情况下工业化。 后用醋酸锂转化法将重组质粒转化入毕赤酵母宿主菌GSIl5，通过选择性培养基MM和 MD筛选出重组毕赤酵母菌株．用0．5％甲醇诱导表达，在最适温度30C的环境条件下。 诱导表达出活性蛋白，用硫酸铵浓度梯度沉淀初步纯化酵母真核表达产物，通过细菌低 温保护实验检测抗冻蛋白TmAFP低温保护功能，同时探讨抗冻蛋白TmAFP在酸碱环 境和100℃时的稳定性。研究表明TmAFP真核表达产物在低温下能够提高细菌的存活 率，能够耐受高温和一定程度的强酸强碱。 关键词：黄粉甲，抗冻蛋白，酵母表达，热滞活性，抗冻活性，毕赤酵母 Abstract Antifreeze proteins are theyalsonamed∞thermal are tofunction the hysteresisproteins(THPs)．AFPsthought byinhibiting ofsmallice and growth thestructures the ofice crystals，changing inhibitingrc-crystalizationcrystal by tothesuTfaccoficewith insectantifreeze be bonds．Therefore，the adsorbing hydrogen proteinmight fully to fieldssuchasthe of and in appliedmany storageooq,t∞，spermatozoa organ embfyos,especially for ahot thatthebasicresearchonantifreeze cryopreservationtransplantation．Its aspect becoming of are to AFPsin proteins(AFPs)andapplicationbiologytechniqness．PeopleCXpreS$the tryi