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重温经典、引领创新 —— “金品”服务科研 北京全式金生物技术有限公司 • “Easy”克隆技术——快速、高效“1+1” • “Flycut ”————快速限制性内切酶 • “TransStart”——最好的热启动技术 • “FastPfu”——快速高保真酶 • “TransDirect PCR” ——无需纯化gDNA 的PCR • “TransScript” ——高温反转录酶 • “All-in-One”——简单到极致的反转录 • “EasySee”—— Western Blot可视化 • “Luciferace”—报告基因检测的生力军 • “TransDetect” —细胞凋亡检测 研发指导理念 原理创新，使用便捷——“Fast 、Easy ” “Easy”克隆技术 开发思路 操作简单：载体+片段 反应快速：酶本身具有的特性 连接高效：连接反应成为双分子作用过程 • 常规的连接是一个三分子共同反应的过程。 • TA克隆中粘性末端仅有一个碱基，因此较高 的DNA浓度和较高T4连接酶浓度是获得较高 连接效率的前提。 • 环化过程恰恰与连接过程相反，过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间 相互作用促进串连体(concatemer)形成。 • 通常情况下, 克隆效率（连接产物转化效率，而不是克隆阳性率）低于0.1% 。 拓扑异构酶的功能 EASY 克隆原理 连接反应成为一 个双分子作用的 过程 EASY 克隆  利用 Vaccina Virus Topoisomerase (TOPO) ，与载体结合 (牛痘病毒的拓扑异构酶) 酶特点  由314个氨基酸组成 识别5’-C/TCCTT-3’  同时具有限制性内切酶(nick enzyme)和连接酶的功能 工作所需缓冲液条件宽泛 不需要外界提供能量 80%的连接反应在2分钟之内即可完成 传统TA载体和TOPO载体稳定性、自连率的比较 P vector ddT PCR dA dA product Tdd vector P 载体的选择 EASY 克隆和T4 DNA Ligase克隆比较 （TOPO载体和普通TA载体比较） EASY 克隆 T4 DNA 连接酶克隆 无需纯化可直接用于克隆 需要纯化 PCR产物 （若无杂带和引物二聚体） (PCR缓冲液抑制连接) o o 过夜（12-16小时)/12- 反应时间/温度 5分钟/室温(20 C-37 C) o