Southern杂交技术手册.doc

Southern杂交 探针标记及检测试剂盒：DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II （detection with CSPD） 原理 所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和DIG-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检测采用CSPD发光曝光到X光片。 试剂盒内容： 1. DIG-High Prime，vial 1，50ul（5×）； 2. 地高辛标记的对照DNA，vial 2，20ul（5ug/ml pBR328 DNA）； 3. DNA稀释缓冲液，vial 3，（3×1ml）； 4. AP Conjugate，vial 4，50ul（750U/ml）；开封后2-8℃稳定保存。 5. CSPD，vial 5，50 ml；开封后2-8℃避光稳定保存。 6. Blocking solution（封闭液），vial 6，4×100ml（10×）；开封后应分装，在-15～-25℃稳定保存，或2-8℃保存1个月，工作液应现用现配。 7. DIG Easy Hyb Granules，vial 7，4×100ml。 1 表1 需准备的其他试剂及设备 试剂配制： 1. 马来酸缓冲液——0.1 M马来酸（M.W. 116.1），0.15 M NaCl，NaOH固体调pH至7.5，常温（称取11.61g马来酸，8.77g NaCl，定容至1000mL，高压灭菌）。 2. 洗脱缓冲液：取灭菌后的马来酸缓冲液，加入0.3%（v/v）的Tween-20，常温。 3. 检测缓冲液——0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 9.5，常温（取1 M Tris-HCl 50ml，2.925 g NaCl，定容至500ml，高压灭菌）。 4. 0.5 M EDTA——187 g EDTA-Na2盐加入约 800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值在8.0左右，再用pH试纸略加调整即可, 灭菌后于室温保存。 5．5×TBE—— 约800 ml蒸馏水中加入Tris-base 54 g，硼酸27.5 g，充分溶解后加入20ml的0.5 M EDTA（pH 8.0）再用蒸馏水定溶到1000 ml, 于室温下短期存放。 2 6． 酸变性液—— 0.125M HCl （取11ml HCl加蒸馏水定容到1000ml，室温可放置1个月） 7．碱变性液—— 1.5 M NaCl，0.5 M NaOH（取87.66g NaCl，20g NaOH，定容至1000ml，室温可放置3个月） 8.中和液——0.5 M Tris-HCl，1.5 M NaCl（取87.66g NaCl，60.5g Tris- base，定容至1000ml，用HCl调整pH值到7.5，室温可放置3个月） 9．20×SSC——3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠（175.5g NaCl，88.2g柠檬酸钠，10 M NaOH调pH至7-8，定容至1000ml，高压灭菌） 10. 1% SDS——5g SDS，蒸馏水溶解定容至500ml，室温可放置3个月 11. 显影液： 温水（约50℃） 米吐尔（对甲氨基酚硫酸盐） 无水亚硫酸钠 几奴尼（对苯二酚） 无水碳酸钠： 溴化钾 加冷水至 800 ml 3.5 g 60 g 9.0 g 40.0 g 3.5 g 1000 ml 12.定影液 热水（60-70℃） 结晶硫代硫酸钠 无水亚硫酸钠 醋酸 硼砂（四硼酸钠） 钾矾 加冷水至 600 ml 240 g 15 g 48 ml 7.5 g 15 g 1000 ml 3 一、DIG标记探针的制备 A、1ug模板DNA加适量双蒸水至16ul； B、沸水浴中煮10min，变性模板DNA；迅速在冰水混合浴中冷却3-5min； C、涡旋混匀DIG-High Prime（vial 1），取4ul加入已变性的模板溶液中，混匀，2000rpm，30s； D、37℃孵育1h或过夜； E、加入2ul 0.2M EDTA溶液或65℃加热10min，终止反应； F、标记探针在-20℃可至少保存