肾小管上皮细胞基部内陷细胞膜呈现atp酶阳性反应产物硫胺焦磷酸酯酶.ppt

* * 第三节、TEM生物样品特殊制备技术 在EM形态学研究中，应用组织化学、免疫学等各种标记技术观察细胞内各种成份在亚分子水平上的分布情况，以及这些成份在细胞活动过程中的动态变化，从而将结构与功能的研究结合起来，使EM不仅研究细胞的细微结构，还将其功能的变化反应出来。它研究的内容有：①EM酶细胞化学技术。②EM免疫细胞化学技术。③免疫酶标技术。④免疫胶体金标记技术等。 1、EM 酶细胞化学技术 ⑴ 研 究的目的： 酶细胞化学技术是在 TEM下观察细胞内酶的化学反应产物，根据这些反应产物来研究相关的酶在组织细胞内的存在部位、功能及其动态变化，阐明组织细胞的结构与功能的生物学意义。由于酶不具有形态上的特征，所以细胞内酶的鉴定常依赖细胞化学技术。其特点是将特定的反应产物，形成高电子密度不溶性沉淀物，借助电镜做亚分子结构的原位分析。 ⑵ 反应的基本原理 在组织细胞内存在着某些特定的酶，这些酶又都有各自的特定位置，因此细胞内酶的定位因酶的种类不同而异。酶反应可分二个阶段。第一阶段，细胞内的酶与底物作用产生初级反应产物，第二阶段，初级反应产物在捕获剂作用下形成不溶性沉淀即终反应产物。 酶 捕获剂 底物-----------初级反应产物------------终反应产物 （可溶性） （不溶性） 酸性磷酸酶 柠檬酸铅 Β-甘油磷酸钠--------------无机磷酸-------------磷酸铅 (底物） （初级反应产物 ） （终反应产物） 总之细胞内各种酶在反应底物、反应条件、反应产物及捕获剂机制上各不相同，但它们的共同点是，酶与特异性底物作用后，经过捕获反应，在特异性反应部位生成电子致密的沉淀物，从而在电镜下检出酶存在的部位。 ⑶ 实验程序和要求 EM酶细胞化学技术是在TEM常规生物制样技术，取材、固定、脱水、浸透、包埋、半薄切片、超薄切片的基础上添加孵育反应步骤来进行的。 A: 取材固定 2%多聚甲醛＋0.5 %戊二醛 固定 24小时 B: 振动切片 30－40um C：孵育反应 37℃ 30分钟 D: 后固定 1%OsO4 60分钟 E：脱水、浸透、包埋、超切 实验程序中的注意事项 ① 取材和固定： TEM酶细胞化学的取材，与常规取材一样，要求组织新鲜，动作迅速。组织大小在2mm3左右，温度0～4℃。选用醛类固定剂，因为醛类固定剂，能够保存酶活性的40～70％，同时它能将保存下来的酶固定在原位，防止酶扩散。另外它还能使细胞膜的半透性发生改变，使原来很难进入细胞内与酶发生反应的物质，如孵育介质中的底物、捕捉剂等,快速通过细胞膜进入细胞内与酶发生反应。常用的醛类固定剂有几种，按照保存细胞微细结构的优劣，依次为戊二醛、甲醛、丁稀醛、羟基已二醛等。 醛类物质对不同细胞器的固定和对酶的活性作用 在选择固定剂时，首先考虑保存酶的活性，后考虑结构的保存。由表可见，戊二醛的固定作用优于甲醛，而甲醛保存酶的活性作用大于戊二醛。因此电镜细胞化学技术中常用戊二醛和甲醛的混合液进行样品固定。 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ 优秀 一般 酶活性 ＋＋ ＋＋＋ GOL体 ＋＋ ＋＋＋ 核周隙 线粒体 内质网 ＋＋ ＋＋＋ 胞基质 甲 醛 戊二醛 细胞器 从理论上讲，若想保存好样品，需充分固定。但固定越彻底，酶的失活越严重。要想保存酶的活性，最好是先孵育后固定，但先孵育导致细胞微细结构的损伤，反应不均，酶反应物扩散、流失，出现与酶无关部位定居的假象。这些矛盾是EM细胞化学技术中的难点。在EM酶细胞化学技术中酶的失活、丢失是不可避免的，细胞微细结构的破坏也是不可避免的但是应当尽量减少固定剂造成酶的失活与丢失，减少孵育液对细胞微细结构的损伤破坏。 固定剂的选择根据样品而定，例如，Mit的标志酶，琥珀酸脱氢酶对固定剂很敏感，需组织先孵育后固定的方法。水解酶ACP、ALP、ATP酶等对固定剂耐受性比较强，可以用高一点浓度的固定剂，时间可以长一点。氧化还原酶对固定剂耐受性差，用低浓度的戊二醛和多聚甲醛混合固定，时间短一点。这些都可以减少酶的失活和良好保存细胞的微细结构。 ② 孵育反应（酶的定位反应） 概念：被检样品