高效液相色谱（HPLC）分析技术及其应用.pptVIP

大型分析仪器技术讲座 ------高效液相色谱（HPLC）分析技术及其应用 暨南大学实验技术中心 欧云付 色谱历史的回顾 1、1903年，俄国植物学家Tswett（茨维特）研究植物叶子组成，用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物，发现三种颜色六条色带，他把这种色带称为“色谱”。1906年，发表于德国植物学杂志，属于液固色谱法。 2、1940年，Martin 和 Synge 提出液液分配色谱；1941年他们提出了气相色谱可能性； 3、1949年，Macllean 制作了薄层板，使TLC得以应用； 4、1952年，Martin 和 Synge发展了气相色谱，并获得了诺贝尔奖； 5、60年代末，出现了商业高效液相色谱 HPLC，但是由于泵、检测器的发展滞后，使得HPLC在80年代以后才得以迅速发展。 一、高效液相色谱法 1、 高效液相色谱法是近二十几年来发展起来的一项新颖、快速的分离分析技术。液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。 2、液相色谱的分离原理：根据样品中各组分在色谱柱中与固定相及流动相之间的相互作用的差异来分离样品中的组分。 3、高效液相色谱法。在经典的液体柱色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。这种柱色谱技术称做高效液相色谱法。 4、常用的液相色谱类型 正相、反相色谱的划分标准：比较流动相和固定相的大小。 正相色谱：流动相极性固定相极性 反相色谱：流动相极性固定相极性 ? 正相色谱：分离在水中绝对不溶解的物质或同分异构体，约占10% 的应用； 反相色谱：用于常规分析，占80%应用； 离子对色谱：可看作是反相色谱的一个特殊应用，需要在流动相中加入离子对试剂； 离子交换色谱：需要特殊的柱子和检测器，与离子对色谱的应用范围相同但原理不同； 体积排阻色谱：大分子先流出，小分子后流出。不同的柱子分离的样品分子量的范围不一样。需要有专门的软件。（a：水相流动相称为凝胶过滤色谱GFC； b：有机流动相称为凝胶渗透色谱GPC）。 二、高效液相色谱法和气相色谱法的比较 三、分析型液相色谱 HPLC (Analytical Mode)Agilent 1100 Series （一）、HPLC的构成框图 （二）、高效液相色谱的基本组成 1、流动相传输系统 2、进样系统 3、柱分离系统 4、检测系统及输出设备 2、进样系统 （1）、自动进样器 （2）、样品定位盘 3、柱分离系统 （1）、色谱柱 （2）、控温装置 （3）、保护柱 （1）、色谱柱 a、Hypersil ODS C18 4.6mm× 250mm 5μm b、ZORBAX SB—C18 4.6mm× 150mm 5μm c 、ZORBAX Carbohydrate 4.6mm× 150mm 5μm d、ZORBAX Eclipse XDB—C8 4.6mm× 150mm 5μm e、ZORBAX SB—Aq 4.6mm× 250mm 5μm f、ZORBAX Extend—C18 4.6mm× 250mm 5μm g、Poroshell 300SB-- C18 4.6mm× 250mm 5μm a、 Hypersil ODS C18柱 Hypersil ODS C18 适合用于分析非极性到中等极性的溶质。如酸、中性的和脂溶性的化合物等。 pH 使用范围 2~8。 b、 ZORBAX SB—C18柱 用于分析碱性、酸性、中性化合物。在低pH下超常稳定。耐高温至90℃。在分析酸性、中性化合物时， ZORBAX SB—C18与ZORBAX ODS C18相类似，但在分离碱性化合物时， ZORBAX SB—C18能提供更好的色谱性能。对一些碱性化合物的分离，它不需要碱性改性剂，如三乙铵，就能获得有效的、对称的色谱图。 pH 使用范围 1~8。 c、 ZORBAX Carbohydrate柱 氨基丙基柱填料，分离单糖和糖化合物 d、 ZORBAX Eclipse XDB—C8柱 在中性到较低pH条件下分离碱性、酸性、中性化合物，稳定性强。在较低pH下能够得到良好分离，在中性条件下峰形更好，如多肽，在中等pH条件下能够得到良好的峰形。 pH 使用范围 2~9。 e、 ZORBAX SB—Aq柱 用于强极性化合物分离，在高水含量流动相中有强保留，无固定相塌陷。 ZORBAX S