分选知识讲座-zenglingwu.ppt

预实验，使用Unlabled Beads稀释Rainbow Beads，至Rainbow比例在0.1% - 0.05%，先分选液滴到96孔板孔中，再分选单细胞到液滴上（注：开始尝试分选到96孔板盖子上，但是在荧光显微镜下无法调节准确聚焦，所以分到孔中再观察）。先分选了几组单孔4个细胞观察分选效果，结果如下，清晰数到4个细胞。  Case1 Single Cell Sorting 分选单个微球，共分选4X12=48孔，然后荧光显微镜下随即挑取4孔观察，确实均是单细胞，附近没有其他微球，结果如下： 因为是先分液滴到孔中，再分小球，更细心的观察，会发现有些微小液滴在镜下看起来有点类似小球，而通过调节焦距可以在绝大多数情况下排除它们是微球的可能。 用Rainbow和大微球混合，或者Nile Red/Blue混合后进行分选，效果会更好。  Single Cell Sorting 注意：对齐液流角度很重要，液滴必须打到管底(PCR板放平在96孔板上，注意每次放在同样的位置，卡紧，不要晃动)，注意板子不要碰到流式细胞仪的部件，特别是上面的白色橡胶，必须通过预实验验证。  Single Cell Sorting 单细胞分选精度验证 FACS Aria II 分选荧光微球至96孔板，目标数分别设定为1个x10组、3个x10组及5个x10组，分选后通过荧光显微镜验证分选精度，在每个实验组中均能检测到所设定的荧光微球个数，无一误差，分选精度高。 单细胞小鼠HSC分选 单细胞分选--Single B cell 地坛医院 清华大学 国家CDC 转基因小鼠神经元细胞分选 SORP Aria成功分选出转基因小鼠大脑特定区域神经元细胞，实验用于研究特殊基因的表达对于小鼠行为的影响。实验中的神经元样本活性要求极高，需可测量到生理电位。阳性细胞含量仅为0.4%。使用96孔板分选出9万GFP阳性细胞用于下游实验。分选后细胞培养当天可见细胞贴壁生长，活性好。 显微镜下观察细胞 转基因小鼠神经干细胞分选 用BD FACSAria II分选GFP转基因小鼠的GFP+细胞（神经元细胞为主）和GFP-细胞（神经干细胞为主）细胞。收集GFP+和GFP-细胞各2x105个，种植到60孔板中 ，贴壁培养后1小时，显微镜下计数细胞，每孔孔内细胞数量160-170个 ，分选后验证与细胞分选总数量基本没有误差，得率高。分选后细胞培养当天可见细胞贴壁生长，可观察到少量细胞分裂，活性好。 神经元细胞 神经干细胞 血尿中异常红细胞的鉴定及分选 用BD FACSAria II成功鉴定和分选出血尿中异常红细胞。下图为分选出均一红细胞与非均一红细胞。可以看到分选后的脆弱红细胞依然形态完整。 成功建立孤雄囊胚的单倍体胚胎干细胞系，证明这些细胞保持了一定水平的雄性印记，进一步验证这些细胞能够代替精子在注入卵母细胞后产生健康的小鼠。 Cell 149, 605–617, April 27, 2012 Nature 479, 131–134. 2011， Leeb, M., and Wutz, A. 中科院动物所周琪研究组和赵小阳研究组合作，首次实现了利用基因修饰的单倍体胚胎干细胞获得健康成活的转基因哺乳动物，为灵长类等大动物的基因功能研究及疾病模型的建立开辟了一条新的道路。该成果已在国际顶级学术期刊《Nature》上发表，研究中所涉及单倍体分选均由BD FACSAria II完成。 小鼠精原细胞倍性分析 使用SORP Aria进行小鼠睾丸精原细胞倍体分析，可清楚看到各倍体：P1(N)，P2(2N)，P3(4N)。 从可溶性蛋白的检测－－信号转导蛋白的筛选9-Plex for Measuring T Cell Activation 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. Itk (Y511) 2. ERK (T202/Y204) 3. JNK (T183/Y185) 4. P38 (T180/Y182) 5. PLCg (Y783) 6. ZAP70 (Y319) 7. LAT (Y171) 8. c-Jun (S63) 9. RSK (S380) Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-CD3/CD28 1 10 100 FOLD INCREASE IN UNITS/ML 0 5 10 15 20 TIME (MINUTES) RSK (S380) Jun (S63) LAT (Y171) Itk (Y511) ZAP-70 (Y319) PLCg (Y783) P38 (T180/Y182) JNK (T183/Y185) ERK (T202/Y204) P-Specific Antibod