医学课件第三章液相色谱-质谱联用技术讲解课件.ppt

第三章 液相色谱—质谱联用的原理及应用;液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。 ;液相色谱-质谱联用要解决的重要问题;一、 LC-MS联用的接口技术;2）ESI接口的结构 ESI 源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子光学系统。;;电喷雾：现在常见的喷嘴是内径为0.1mm 的金属毛细管。在它上面施加3～8kV 的电压时。由于毛细管的顶端很窄，形成的电场强度可高达106 V/m 。当流速为0.5～5μL／min 的LC 流出物溢出金属毛细管顶端时，会形成扇状喷雾。它是细小的液珠和溶剂蒸气的混合体。由于高压电场的作用，溶液中带某种电荷的溶质会向液体表面移动，使液珠表面该种电荷过剩。表面过量电荷的正负，视施加在毛细管电极上的电压正负而定。;电喷雾电离源 ESI;电喷雾电离源 ESI;电喷雾接口的主要缺点是它只能接受非常小的液体流量（1～10μL?min-1） 将气动辅助电喷雾技术运用在接口中， 使得接口可与大流量（约1mL?min-1）的HPLC联机使用;2. 大气压化学电离源（APCI）;大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技术，样品溶液从LC流出被气化后，溶剂分子在电晕放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准分子离子[M+H]+或[M-H]-，最后，样品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成。APCI是一种软电离接口技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定。另外，APCI还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图。;优点：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频???，比化学电离的灵敏度高3 个数量级。;大气压化学电离源 APCI;;电喷雾与大气压化学电离的比较;二、LC-MS分析条件的选择和优化;2. 正、负离子模式的选择：;3. 流动相的选择;4. 流量和色谱柱的选择;5. 辅助气体流量和温度的选择;六 大 禁 止;;;影响分子量测定的因素;6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时会使多电荷离子比例低，多聚体也减少 7）样品结构和性质 8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好 9）样品浓度;分子量测定中的误判;分子量测定失败的原因;目标化合物分析;（2）母离子扫描;(3) 中性丢失扫描;三、LC-MS的应用;LC-MS应用;;Mesocarb (双苯斯酮胺) ;;;槟榔有效成分的分析;;;1．根据“氮规律”质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个N原子。 2．结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比155的分子离子峰可以得到一个环加两个双键的数值。 3．由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先消去一个中性分子甲基后得到最稳定的140质量数的最高峰。同时根据Beynon表及其最小碎片质量数42的所有可能性可以得到该化合物只能含有不超过两个N原子。（1个） 4．对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。 ;;生物大分子分析;多电荷离子;; ESI 在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常 产生多重质子化的离子。下图是典型的 ESI 质谱图，由一簇不同程度 质子化的分子离子峰 组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两 峰，由下列公式计算所含的质子数 (n) 和样品的分子量 (M)。;13＋;川牛膝HPLC—MS分析;tR=17.67min的色谱峰，一级质谱数据(ESI，MS其为含量最大的峰，结合杯苋甾酮(分子量为520.3)是川牛膝的主要成分，推测该离子峰为杯苋甾酮分子加合一个甲酸根后形成的准分离子峰[M+HCOO]-。又其二级碎片图中有m/z=519.2，其应为杯苋甾酮分子失去一个质子形成的碎片离子峰[M-H]-。有m/z=501.4，这应是由于甾酮类物质中含有较多的羟基，其施加碰撞能后以水分子的形式失去而形成碎片离子峰[M-H-H2O]-。再结合其它的碎片离子与杯苋甾酮的结构相符，因此推断该化合物为杯苋甾酮。;;;;麻黄类生物碱