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分子生物学研究技术 Methods in Molecular Biology;参考书籍;考核方式;DNA重组四要素 DNA文库的构建 聚合酶链式反应 基因重组(克隆)方法 基因突变,DNA序列测定 重组产物的表达、分析和纯化 示踪与杂交技术 遗传多样性研究中的分子分子生物学方法 功能基因组学研究技术 生物信息学 生物安全;第1章 DNA重组的四要素;本章提要;1、 DNA重组技术;2 、DNA重组技术中用到的工具酶;DNA重组技术中用到的一些工具酶;3、限制性内切酶的发现、分类及使用;噬菌体在不同的菌株中的生长不同，在某个菌株中生长得很好的噬菌体，在新菌株中则生长得很差。 个别噬菌体逃脱“限制”后，在新菌株中同样可以长得很好，获得了特定的“修饰”，使它们不受宿主的“限制”。;1968年，Werner Arber等在大肠杆菌的抽提液中发现了限制性酶活性； 同年，Meselson和 Yuan从另一种大肠杆菌菌株中纯化出了第一种限制性酶； 1970年，Hamilton Smith从嗜血流感菌Rd菌株得到两种限制酶。;限制/修饰系统是细菌的“免疫”系统;限制内切酶从核酸链中间水解3’-5’磷酸二酯键，将核酸链切断； 限制修饰系统按组成、作用特点分三类，来源于这些系统也有三类限制酶； 类型Ⅰ、Ⅲ，具有限制酶活性，又具有修饰酶作用，识别位点特异，但切割位点非特异或在识别位点外； 有实用价值是Ⅱ型限制酶，酶蛋白只有切割DNA活力，无甲基化作用，且在识别顺序和切割位点有特异性，切点一般在识别顺序;;EcoK EcoB识别位点与切割位点不同，是Type I限制酶;;限制性内切酶命名规则;4 酶切反应;同步双酶切和分步酶切;TaKaRa限制酶在各种buffer中的活性;双酶切buffer表;星号活性(Star Activity);IIS型酶;IIS型限制酶Fok I的识别序列：;IIS型限制酶的妙用：SAGE技术;;SAGE 分析;同尾酶与同裂酶;利用同尾酶进行重组;利用同裂酶对DNA甲基化敏感性的差异进行DNA甲基化研究;5 载体(vector);载体的一般要求;常用载体类型;质粒载体Plasmid vector;质粒载体的功能; 6 质粒载体(plasmid)实例;pBR322质粒;pBR322的一个优点是具有较小的分子量； 规定pBR322质粒分子核苷酸计数：EcoRI识别位点(GAATTC)中的第一个T为1，沿着从tetr基因到ampr基因按顺时针方向计数,pBR322质粒DNA分子长度是4361bp。;pBR322质粒载体具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号。;;pUC19/18质粒载体;pUC19/18的限制酶切图谱;α-互补现象;DH5α细菌(用重组pUC19质粒进行了转化)生长在LB琼脂固体培养基上(加氨苄苄青霉素及IPTG+X－Gal);穿梭质粒;;质粒载体的不足;7 质粒的分析技术-DNA凝胶电泳技术;简单实用的分离分析DNA的方法，电场作用下带负电的DNA向正极迁移； 小分子容易快速地通过凝胶孔隙； 大分子(几百kb)必须改变构型通过凝胶孔隙； 分辨率满足常规要求，分离分子大小从几百bp到几十kb； 常用荧光染料溴化乙锭对胶里面的核酸分子进行“染色”，紫外灯下观察分离条带。;;溴化乙锭（EB）;琼脂糖凝胶电泳彩色照片（波长260nm）;琼脂糖凝胶电泳彩色照片：可见光和紫外光下;新的核酸荧光染料-替代EB;影响DNA迁移速率的因素;非荧光DNA染料;凝胶浓度;电泳缓冲液;凝胶成像系统得到的灰度照片;脉冲电场凝胶电泳（PFGE）;脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE);正交场脉冲凝胶电泳（OFAGE）: 利用两个或多个交变电场，使200-3000 kb的DNA分子发生分离，其电极排列可以是双向非均匀，单向非均匀等; 场倒置凝胶电泳（FIGE）: 利用常规电泳槽进行电泳，但电场方向则是周期性地发生倒置，其正向和反向的脉冲时间长度之比为3或其它值。该法可使15-700 Kb或以上的DNA分子发生分离; 为了克服不同大小DNA分子一起移动，可以采用转换时间递增法（swiching-interval ramps）, 即由电泳开始时的短脉冲时间逐渐递增到电泳结束时的长脉冲时间，如开始时为60：20，结束时可为180：60。 CHEF(Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields) 动态调控闭合均一电场电泳;;;各种脉冲场凝胶电泳技术的比较 ? 方法 染色体带 最大带 最小带 动态调节 直道 均匀电场 液体样品 机械转换 CHEF 15 12000kb 88 bp 是