分子生物学实验(修改版)幻灯片教程.ppt

分 子 生 物 学 实 验 河南##大学生理生化教研室 ;;实验一 质粒抽提;实验操作基本要求;质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。 天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。 质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。;;;质粒中的多克隆位点;一、实验目的;细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。; SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。 ; 释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。 离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 ;实验器材：电子天平、锥形瓶、气浴摇床、离心 机 实验试剂：溶液I 、溶液II、溶液III、TE、氯仿、 乙醇 ;;培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液I，充分混匀;置冰上; 加入200?l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（溶液II ），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置2--3min;;加入150 ? l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min; 用台式高速离心机，12000r/min离心10min，上清移入另一干净离心管，并加3ul RNaseA, 37C保温45min; 上清中加入等体积的酚/氯仿抽提一次,等体积氯仿抽提一次;每次均要振荡—离心(10000rpm离心1min) —吸取上清到新的离心管中; 上清中加入1/10 体积3M乙酸钠溶液(pH5.2) ,和2.2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃保存。;8. 12000rpm 离心15分钟，弃去上清，沉淀加入1ml 75％乙???洗涤， 12000rpm 离心2分钟，彻底弃去上清，烘干。 9. 沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 电泳检查;接种环接种菌落时，一定要冷却彻底，否则容易接种失败； 提取质粒过程中，每一步都尽量多吸取溶液，以得到更高的产率； 用TE溶解沉淀的时候，用移液器小心吹打几次即可。;六、实验结果; 一般细菌中的基因组DNA含量相当高，为什么利用碱裂解法提取出来的大部分是质粒DNA而不是基因组DNA？;实验二  聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段; 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现，使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。;掌握PCR的原理； 学会使用PCR仪； 能利用已知序列设计引物进行一般的PCR实验。; 类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板； 而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链； 在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。;; 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。 如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 ;PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。;