第八章节酶定向进化.ppt

*/169 */169 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。 ③优点： 连上后就能用。 ④缺点： 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。） ⑤防止自我连接 8.3.2 酶基因突变的定向选择--基因重组 */169 5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’ CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’ 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！ 5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’ 5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’ CIP处理 -OH HO- */169 突变文库的组装是将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体的过程。 对于重组质粒载体可以通过细胞转化等方法将重组DNA转入受体细胞，形成突变基因文库 对于重组噬菌体DNA载体，需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，成为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。 8.3.3 酶基因突变的定向选择 (三)构建突变基因文库 */169 大肠杆菌转化（transformation) E. coli 感受态细胞 感受态制备 0℃，0.1MCaCl2 加入质粒 42℃热激 90 s， 立即冰浴 富裕培养 抗性筛选 LB-抗生素 8.3.3 酶基因突变的定向选择--构建突变基因文库 */169 in vitro packaging of lambda phage */169 重组λ噬菌体转导（transduction) 8.3.3 酶基因突变的定向选择--构建突变基因文库 */169 重组λ噬菌体转导(transduction) */169 根据定向进化的目的要求，在一定的环境条件下进行筛选，从突变基因文库中选取得到所需的突变基因。 突变基因文库 质粒载体 噬菌体载体 转化 转导 目的基因 筛选 8.3.4 酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选 */169 （一）定向选择环境条件的设定 根据定向进化的设定选择环境 在每一次“突变——筛选”的循环中加以调整选择环境 （1）提高酶的热稳定性： 较高温度下培养重组细胞，每次循环提高温度。 （2）提高β-内酰胺酶的催化效率： 一定浓度的β-内酰胺类抗生素中培养，每次提高浓度 8.3.4 酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选 */169 细菌 诱发突变的因素 50 0C培养 突变体库 选择压力 耐受型突变体 一定浓度的β-内酰胺类抗生素 8.3.4 酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选 （一）定向选择环境条件的设定 */169 （二）高通量筛选技术 高通量筛选技术要求： 通量大、效率高，在较短时间内简便的判断出正突变基因，并易于排出那些无效的突变基因。 常用高通量筛选方法 平板筛选法 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 细胞表面展示法 核糖体表面展示法 8.3.4 酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选 */169 （二）高通量筛选技术 */169 1、平板筛选法 平板筛选方法是将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法。 特点： 简便、快速、直观、容易控制和调整环境条件 依据： 重组细胞的表型 细胞生长情况 颜色变化情况 透明圈情况 8.3.4 酶基因突变的定向选择--突变基因的筛选 高通量筛选方法 */169 （1）依据细胞生长情况筛选突变基因 热稳定性：温度梯度和高温环境 抗生素耐受性：抗生素浓度梯度 pH稳定性： pH梯度 极端环境：高盐、低温、 高浓毒物质 */169 （2）依据颜色变化筛选突变基因 反应产物显色 蓝白斑筛选（Blue white screening）： lacZ’ Am N2H ?片段 COOH ?片段 */169 （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 C端序列 LacZ酶 ?-galactosidase Blue/ white screening or Lac selection 诱导物：IPTG 底物：X-gal */169 */169 磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚； */169 Homogenized activated sludge sample cultured on 1/10-strength LB plates amended with CPQP and viewed with (A) white light and (B) fluor