第四章高效液相色谱5课时.ppt

21-1 概述 一、高效液相色谱与气相色谱的比较 二、高效液相色谱的分类 三、高效液相色谱的特点 一、高效液相色谱与气相色谱的比较 分析对象 流动相 色谱柱温度 分析对象 气相色谱：气体和沸点较低的化合物， 占有机物总数20% 高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、 分子量大的物质， 占有机物总数80% 流动相 气相色谱流动相：对组分没有亲和力的惰性气 体，对分离选择性几乎无影响 高效液相色谱流动相：可选用不同极性的液体 选择余地大 对分离影响大（与组分或固定相均作用） 色谱柱温 气相色谱柱温： 一般较高 高效液相色谱柱温：通常为室温 二、高效液相色谱的分类 按分离原理分类： 正相色谱 反相色谱 离子交换色谱 尺寸排阻色谱 疏水作用色谱 亲和色谱 手性色谱 二、高效液相色谱的分类 按分离规模分类： 制备色谱 柱内径10mm 半制备色谱 柱内径5-10mm 分析型色谱 柱内径 5 mm 三、高效液相色谱的特点 高压 150 - 350 ?105 Pa 高速 一般 1 h, 1min. 高效 柱效高 高灵敏度 10-9 g (紫外检测器） 10-11 g（荧光检测器） 偏转式示差折光检测器光路图 示差折光检测器使用要点 流动相组成要恒定（变化值10-6） 温度恒定 （样品池与参比池的温差 ±10-4 ?C) 压力恒定 （检测池不耐压） 流速稳定 （流量波动5%） 不可用于梯度洗脱 （5）蒸发光散射检测器 通用型检测器 不需要衍生便可检测任何不带发色基团的化合物 比示差折光检测器更佳的灵敏度及稳定性 对温度变化不敏感 可用于梯度洗脱 响应值与样品质量有关，对所有样品的检测给出近乎一样的响应因子 测定物质的纯度和定量测定未知物 蒸发光散射检测器(ELSD) 蒸发光散射检测器工作原理 ELSD 和RI的基线稳定性及灵敏度比较 应用例1 应用例2 应用例3 (6)电导检测器 基于物质在某些介质中电离后所产生电导变化进行测定的检测器 主要应用于离子色谱 受温度影响较大 电导检测器结构示意图 (7)联用技术 HPLC-MS HPLC-NMR HPLC-FTIR (8)梯度淋洗装置 低压梯度 高压梯度 21-5 化学键合相色谱 采用化学键合相作为固定相的液相色谱称化学键合相色谱法 特点： 固定相稳定性好 适合于梯度洗脱 应用范围广 化学键合相色谱 键合固定相类型 键合固定相的制备 反相键合相色谱法 正相键合相色谱法 一、键合固定相类型 键合固定相的基质材料主要为硅胶 （1）疏水基团 不同链长的烷烃（C8, C18）和苯基等 （2）极性基团 氨丙基、腈乙基、醇和醚等 （3）其它基团 离子交换基、手性识别基、配基（如酶、抗原、激素等） 二、键合固定相的制备 （1）硅酸酯 二、键合固定相的制备 （2）Si - C 和 Si - N 型 二、键合固定相的制备 （3）硅烷化 三、反相键合相色谱法 流动相极性大于固定相的色谱法 固定相 保留机理 溶剂强度 溶剂选择性 流动相及其选择 应用例 （1）固定相 最常用的固定相： C18 (ODS: chemically bonded octadecylsilane) C8和其它短链烷烃、苯基键合硅胶固定相 ODS示意图 （2）保留机理 试样组分的流出顺序 组分流出顺序为： 疏水性小者先流出 疏水性大者后流出 （3）溶剂强度 反相液相色谱最常用的溶剂： 甲醇 (methanol)、乙腈 (acetonitril)、四氢呋喃 (tetrahydrofuran)、水 用极性参数 P 表示 极性大，强度弱； 极性小，强度强 （为什么？） Pmethanol 5.1 Pacetonitril 5.8 Ptetrahydrofuran 4.0 Pwater 10.2 色谱柱 柱材料：不锈钢 柱长度： 5 - 30 cm 柱内径：2 - 5 mm 填料：3 - 10?m 填充：匀浆法 高效液相色谱柱 高效液相色谱柱 匀浆法装柱示意图 匀浆法装柱示意图 色谱柱色谱性能的评价 柱效：理论塔板数 不对称因子 渗透性 渗透性 渗透性 K 定义为： 高效液相色谱填料 填料热力学特性影响色谱柱的选择性 填料的动力学性质或结构特点影响色谱柱的效率 颗粒的大小、形状、均匀性、表面积 孔径、孔体积等。