分子生物学研究方法-资料.DOCVIP

第五章 分子生物学研究方法 本章主要内容： 1、重组DNA技术概念及操作步骤 2、工具酶与载体 3、DNA操作技术（转化、阳性克隆的筛选、cDNA文库的构建、PCR等） 4、基因克隆技术 5、基因表达技术 6、蛋白质表达技术 一、 重组DNA技术发展史 从1909年丹麦遗传学家W.Johannsen开始将孟德尔的遗传因子命名为基因到现在出现的克隆羊“多莉”，分子生物学的发展出现了划时代的突破和历史性变革，它已成为生命科学的领头学科。以分子生物学为理论基础，以重组DNA技术为主导的生物技术已日益渗透入农林牧副渔、医药、食品、石油、化工等应用领域，正在取得不可估量的经济和社会效益。让我们回顾一下分子生物学发展史上的重大事件，这样会使我们更加理解重组DNA技术的诞生是历史发展的必然结果。 （一）重组DNA技术诞生的理论基础 随着分子生物学的发展，许多生命的基本现象实质和遗传的奥秘逐渐被揭开神秘的面纱。分子生物学发展史上的三方面成就为重组DNA技术的诞生奠定了坚实的理论基础。 1、年代明确了遗传的物质基础是DNA 1994年O.Avery及其同事们用光滑型（S）和粗糙型（R）两种肺炎球菌的菌株做实验。他们从S型菌的培养物中提取DNA，将其在试管内与R型菌混合，再接种到培养基里，所长出的部分菌落变成了S型，这样的现象称为“转化”。他们发现，加入各种蛋白水解酶，对转化无影响；但加入少量提纯的脱氧核糖核酸酶（DNase）后，转化很快消失，说明引起细菌遗传性状改变的物质是DNA，而不是蛋白质，从而证实了遗传物质是DNA。 2、 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题 在DNA的双螺旋结构建立之前，E.Chargaff已从不同生物来源的DNA中分离出四种碱基，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。他们发现腺嘌呤的量总是和胸腺嘧啶一样（A=T），而鸟嘌呤的量也总是和胞嘧啶一样（G=C），并称之为碱基配对。而（A+T）/（G+C）的比值随不同来源的DNA而有所不同。另外M.Wilkins等已对DNA进行X衍射研究，阐明了有关结构、螺旋性质、线形分子直径、相邻碱基之间的距离等情况。 1953年J.D.Watson和F.H.Crick将E.Chargaff关于DNA碱基组成规律与M.Wilkins等通过X衍射获得的DNA结构资料结合起来，综合分析，提出了DNA双螺旋结构模型。Watson和Crick提出的DNA双螺旋中两条链的碱基互补的特点，预示了DNA复制是半保留复制，同时还指出遗传信息储存在DNA分子碱基序列之中。在1958年，Meselson和Stahl应用重同位素和超速离心的方法证实了DNA的半保留复制。 3、 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题 1958年Crick在DNA双螺旋学说基础上提出了分子生物学的“中心法则”，即通过DNA的自我复制，生物体的遗传信息由父代传给子代，通过转录，遗传信息传给RNA，再通过翻译传给蛋白质，从而决定了生物的表型，这是生物学最基本的规律。 从1961年Nirengerg用人工合成mRNA破译出第一个遗传密码到1969年Crick-Nirenberg确定了全部遗传密码，人们了解了大多数生物遗传信息表达的规律。从遗传密码表中我们可以看到mRNA中每3个核苷酸组成一个密码子，体现一个氨基酸的信息。在64个密码子中,其中61个分别代表各种氨基酸，剩余的3个密码子(UAA、UAG、UGA)mRNA启动部位的AUG还是肽链合成的启动信号，这套密码从细菌到人都可通用。 “中心法则”发现后，科学家又发现了违反“中心法则”的现象。如1970年Temin和Baltimore在研究只有RNA而无DNA的病毒时，发现了反转录酶，该酶能以RNA为模板合成DNA。Temin阐明了反转录现象的机制，“中心法则”的内容得到了扩充。 Watson和Crick使经典遗传学的研究达到了现代的分子水平。DNA的自我半保留复制解释了遗传性状代代相传的稳定性；DNA上一个碱基突变，使三联密码改变，可导致多肽链上氨基酸改变，进而可导致蛋白质生理功能的改变，这样就解开了基因突变之谜，从分子水平上阐明了经典遗传学“变异”的本质，“中心法则”奠定了在分子水平上研究生命现象的理论基础。 Watson和Crick的理论是分子生物学发展史上的重要里程碑，它使人们了解基因指导和编码蛋白质的一级结构（结构基因），但不了解还存在具备其他功能的基因，故它只是揭开了生命基本现象的一部分本质，而不是全部。揭开生命基本现象另一部分本质的是Jacob和Monod。1961年Jacob和Monod提出了操纵子学说，用基因表达调控的原