中性粒细胞相关实验方法.docxVIP

常用中性粒细胞分离方法（外周血、骨髓提取均可）Percoll非连续密度梯度离心法（张灿老师课题组使用方法）优点：Percoll的主要成分是硅石胶，对中性粒细胞的化成成分和活性无影响。回收率高，存活率高。缺点：可能会有部分红细胞分离不干净，影响不大。 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法优点：回收率高和percoll差不多。缺点：由于Ficoll结构中的长链烃组成具有LPS样作用，因此在分离过程中，会对中性粒细胞有激活作用。Dextran作用下红细胞自然沉降法优点：能够完全分离红细胞缺点：回收率最低裂解红细胞法优点：能够完全分离红细胞缺点：回收率低纯度、回收率和存活率检测方法纯度：瑞吉染色存活：台盼蓝计数回收：分离后（计数）/分离前（血常规检测）Percoll非连续密度梯度离心法（张灿老师实验室的方法）和培养备注：使用外周血或骨髓提取都是可以的，一般来说，外周血每1ml能够提取1*10^6 cell，数量比较少，如果骨髓提取，一只小鼠约能提取1*10^7 cell。外周血和骨髓提取除了来源不一样，分离方式是相同的。试剂耗材：percoll原液（pharmacia　or sigma） 10*PBS RPIM1640培养基溶液配制用percoll原液和10*PBS按照9:1的比例（v/v）配成混合液，定义为100%percoll。用1*PBS和100%percoll 配置55%和65%的percoll。（溶液配制均在无菌环境下操作）分离步骤小鼠酒精浸泡消毒。小鼠颈椎脱臼处死，立即切下其后肢的胫骨和股骨，并分离除去所有组织、皮肤。将胫骨和股骨浸泡在不含有血清的RPIM1640培养基中。剪短胫骨股骨两端，用1ml注射器想胫骨股骨中吹灌不含有血清的RPIM1640培养基重悬得到骨髓细胞重悬液，一直吹到骨片泛白为止。将含有骨细胞的RPIM1640培养基4000rpm离心3分钟。用RPIM1640培养基重悬得到骨髓细胞。（2ml）取一个新离心管，加入2ml65%percoll分离液，再加入2ml55%percoll分离液，最后加入2ml骨髓细胞液。（缓慢不要破坏溶液界面）2500rpm离心30分钟。吸取55%和65%交界面，加入1*PBS，1000rpm离心3分钟，弃上清，重复3次。用RPIM1640培养基重悬得到小鼠骨髓中性粒细胞悬浮液。注意：中性粒细胞为终末细胞，不可传代寿命短。张老师组一般细胞和药物共同富裕1小时。3-4小时以内，细胞状态都比较好。PS：也可以用45%55%80%三层分离，500 g离心30分钟，弃上清和55%以上部分，下午55-80%交界面。加入1倍体积的1*PBS，200g离心3分钟，。。。后同。人血浆提取问题新鲜血液，中性粒细胞寿命较短。采学后，用EDTA抗凝处理。具体需血量根据需求来定：每1ml血=1*10^6 cell。 文献说如果做wb，大约要30 ml血液。后续的一些实验方法中性粒细胞tranwell药物趋化实验分离中心粒细胞，测定细胞数transwell小室下室加600ul的趋化因子+无血清培养液上室加入100ul细胞+无血清培养液孵育2小时拿出小室，将上室取出放新的孔内，先将膜上细胞擦去后，再予以离心，将膜下粘附细胞离心至下室，然后予以CCK8间接测定细胞。会有细胞掉到下室，有文献是分开固定计数的。中性粒细胞株只有中性粒前体细胞的细胞株，然后诱导分化得到中性粒细胞。HL60. NB4均可。流式检测凋亡检测和材料接触后凋亡情况用Annexin v 和PI双染，分离后直接标记，标记后应立即检测瑞氏染色有染色试剂盒，按照说明书操作即可。5.尾静脉回输观察