第三代基因测序原理及应用资料.ppt

在单个碱基掺入增长的DNA链时检测它们。当每个dNTP加入时对荧光标记的终止子成像，随后切割，允许下一个碱基的掺入。由于每个测序循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化。根据每个循环的信号强度测定直接检出碱基，与其他技术相比大大降低了原始错误率。最终结果是高度准确的base-by-base测序，避免了序列内容特异的误差，实现了可靠的碱基检出，即使是那些重复序列区和均聚物。 * （4）测序 　　测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。 * （4）测序 　　测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。 * * 该测序是基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在3‘ 末端加上poly(A),以及在poly(A)的末端进行荧光标记和阻断，阻断的目的是防止在测序过程中核苷酸在模板的3’ 末端进行延伸。把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交，poly(T)的作用不仅是捕获模板，也是延伸时的引物。成像来获得已经杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点。加入聚合酶和被Cy3 荧光标记脱氧核苷酸进行DNA 合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未参与合成的的dNTP 和DNA 聚合酶洗脱，直接对Cy3 成像，观测模板位点上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放。加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反应。 这种技术不仅被用在DNA 测序中，把DNA 聚合酶用逆转录酶代替还可以进行RNA 直接测序。 * 该测序也是基于边合成边测序的原理，这项技术的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide(ZMW)(零级波导)。ZMW是一种直径只有几十个纳米的纳米孔，用激光照射ZMW 的底部时，由于底部上的小孔比激光的单个波长还短，因此，激光不能直接穿过小孔，而会在小孔处发生光的衍射，只照亮ZMW 的底部小片区域。DNA 聚合酶被锚定在ZMW 底部的这片区域内，当有单个的脱氧核苷酸加载在DNA 聚合酶上形成新的化学键时，这个脱氧核苷酸上的荧光物质被激活而发光，从而被检测到。还有这个孔很小，在这个小孔内DNA 链的周围，被标记的脱氧核苷酸有限，并且这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速的从外面进入到孔内又出去，由于以上原因，所以形成了非常稳定的并且很弱的背景荧光信号，才使在有大量溶液背景上检测单个荧光标记的核苷酸成为可能。另外一个特点是，荧光标记的位置是磷酸集团而不是碱基，因此可以在没有空间位阻的情况下连续观测到数以千计的碱基。测序的过程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并释放。聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。 DAN 聚合酶的活性在激光的照射下逐渐减弱，所以DNA合成的长度有限。第一代商用的SMRT 测序仪由大约75，000个ZMW 组成，每个ZMW 都可以有一个DNA 聚合酶和一条不同的DNA 样本链，也就是说一次可以同时进行大约75，000个单分子的测序工作。 * Oxford Nanopore 测序技术是以α- 溶血素来构建生物纳米孔，核酸外切酶依附在孔一侧的外表面，一种合成的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔的内表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分子层内，为了提供既符合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件，脂双分子层两侧为不同的盐浓度。在适合的电压下，核酸外切酶消化单链DNA，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂的相互作用，