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优化牛体外生产胚胎条件的研究 草食家畜(季刊)2007年6月第2期(总第135期) 优化牛体外生产胚胎条件的研究 张金花,海里且木,陈静波 (1.新疆农业大学动物科学学院,新疆乌鲁木齐830052; 2.新疆畜牧科学院畜牧所,新疆乌鲁木齐830000) 摘要:为优化牛体外培养系统,本研究利用微滴培养法,探讨了卵巢状态所获卵母细胞,种公牛个体,受 精时间,季节及共培养对体外培养结果的影响.结果表明:(1)不同卵巢状态所获卵母细胞的分裂率,囊胚 率差异均不显着(Pgt;0.05);(2)不同种公牛精液进行体外受精,结果显示分裂率和囊胚率差异显着(Plt;0.05); f3)6h,8h,12h和16h受精时间比较,结果以12h效果最佳,分裂率,囊胚率与其它各组均差并显着(Plt; 0.05).(4)春,秋季体外培养的效果显着优于夏,冬季.(5)使用颗粒单层可显着提高囊胚率(Plt;0.05). 关键词:卵巢;精液;季节;颗粒单层 中图分类号:S814.4文献标识码:A文章编号:1003—6377(2007)02-0027—04 自牛体外受精获得第一头试管牛以来,已对牛卵母 细胞的体外成熟OVM),体外受精(IVF)和早期胚胎的体 外培养(IVC)进行了大量研究,已建立了比较完善的方 法[1】.但是,由于影响牛胚胎体外生产(IVP)的因素多而 且复杂,同一个系统和方法在不同实验室表现不同,有 些影响因素不明确,经过IVM虽然多数的卵母细胞可 以成熟,但经过IVF和IVC后,成功的培养系统也仅有 20%～40%可以发育至囊胚阶段阁.目前的培养效率还未 达到理想效果,卵巢资源利用率低,影响了体外胚胎生 产的产业化.本研究从五个方面对体外培养进行了优化 比较研究. 1材料和方法 1.1试剂 TCM一199,丙酮酸钠,牛磺酸,雌二醇(Sigma公司产 品),E一22570,P一5280,LH,FSH(宁波激素制药厂)等. 1.2卵巢和卵母细胞的采集 牛卵巢采自乌鲁木齐市天鹰屠宰场,置于37~(2无菌生 理盐水中保存,用连有12号针头的10ml注射器吸卵巢表 面直径为2-6mm卵泡的卵母细胞,在体视显微镜下捡卵. 收稿日期:2007—05—10 基金项目:新疆科技攻关项目《肉奶牛胚胎产业化及高 效繁育体系的建立》,项目编号:200131102 作者简介:张金花(1981一),女,新疆人,硕士研究生,研究 方向:动物遗传育种与繁殖. 通讯作者:陈静波(1956一),男,研究员,博士,研究方向: 动物遗传育种与繁殖. 1.3卵母细胞成熟培养 从形态学上将卵母细胞分为4级.A级为卵丘细胞 致密,无扩散,细胞质均匀,形状规则,至少有3层卵丘 细胞完全包裹的卵母细胞;B级为1-3层卵丘细胞包裹 的卵母细胞;C级为半裸卵,卵母细胞外有部分卵丘细 胞存在:D级为裸卵,变形卵,包括退化的卵母细胞.只 选择A,B级卵母细胞用于成熟培养.将清洗好的卵母 细胞置于培养条件为5%C0,38.5℃,饱和湿度条件下 成熟培养22-24h. 1.4精液获能处理及受精 精液获能使用TALP液上游法进行处理,最终受精 精子浓度调整至1-9x106/ml,受精液滴体积为70l,受 精卵的培养液体积为2001~1,均覆盖石蜡油. 1.5颗粒单层的制备 采集完COCs后,取剩余的含颗粒细胞的卵泡液 lml,用胚胎培养液以1500rpm/min离心5min清洗,沉淀 物用5ml培养液悬浮后,再次离心,沉淀物用培养液悬浮, 加入培养液滴,并将其最终浓度调整为lx106个/ml,约 12h后观察,贴壁后有约60%的细胞汇集则可用. 1.6受精卵培养 将受精卵转移至胚胎培养液中,受精后20h观察第 二极体,受精后48h统计卵裂率,每48h半量更换培养 液,6—7d后统计囊胚率. 1.7统计分析 建立数据库,统计分析用spsslO.0进行数据处理. 2结果 2.1卵巢状态对体外培养结果的影响(见表1) 27 2007年6月第2期(总第135期)草食家畜(季刊) 表1的结果显示卵巢黄体侧或对侧体外培养的分2.2种公牛个体对体外培养结果的影响(见表2) 裂率和囊胚率差异均不显着(Pgt;O.05). 表2公牛个体精液对体外培养结果的影响 表2结果显示使用符合国家标准的种公牛冷冻精 液个体问的受精有差异,且差异显着(Plt;O.05o因此在 进行体外培养时需进行精液受精力的测定,尽可能选取 受精效果好的种公牛精液. 2-3受精时间对体外培养结果的影响(见表3) 表3受精时间对体外培养结果的影响 表3结果显示精子与卵母细胞共孵育不同的时间上对体外培养的效果无益处. 以12h为宜,68h的效果较差,而受精时间大于12h以2.4季节对体外培养结果的影响(见表4) 表4季节对体外培养结果的影响 表4结果显示