发酵产物分离纯化知识讲稿.ppt

第六节 发酵产物分离过程;FERMENTATION Process Control;UPSTREAM PROCESSES - genetics, cell … - inoculum development media formulation sterilization - inoculation;DOWNSTREAM PROCESSES - product extraction, purification assay - waste treatment by product recovery; 发酵生产流程可以分为三个阶段; 下游加工过程在生物技术中的地位;生物产品分离纯化的主要特点;;;;;;分离纯化的一般流程;;下游加工过程的一般流程;二、发酵液预处理与固液分离;1 、发酵液的预处理;1 、发酵液的预处理;;预处理的方法;凝聚和絮凝技术;凝聚和絮凝机理;;;2、发酵液的固液分离; 细胞的破碎方法 　　　 按所用方法属性分为物理法（匀浆 法、珠磨法、超声法）、化学法（渗透冲击、增溶法、脂溶法）、生物法（酶溶法）。 ;;化学破碎法 a 渗透冲击 利用渗透压的变化破碎细胞。 b 增溶法 利用表面活性剂等化学试剂的增溶作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破碎。 c 脂溶法 许多有机溶剂能与细胞壁和膜上的脂质作用，导致细胞壁膨胀、破裂，释放出胞内物质。;生物破碎法 加酶促进法 利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。 ;三、初步纯化;1、沉淀法;（1）盐析法;（2）有机溶剂沉淀法;有机溶剂在这个过程的主要作用：;（3）等电点沉淀法;（4）非离子型聚合物沉淀法;2、溶剂萃取法;3、双水相萃取法;;典型的两水相系统;双水相萃取的优点;4、吸附法;作为吸附剂的种类：;5 、蒸发和膜分离法;四、高度纯化;层析法;层析法的基本原理;层析技术的分类;1、 离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC) ;（1）基本原理 ;;;阳离子交换剂 ;;阴离子交换剂;;;;;等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。;２、离子交换层析基本操作 利用离子交换层析分离纯化生物大分子可以采用两种方式： 一是将目的产物离子化，然后被交换到介质上，而杂质不被吸附，从柱中流出，称为正吸附。 二是将杂质离子化后被交换，目的产物不被交换而直接流出，称为负吸附。 ;;（１）离子交换剂的选择 选择合适的离子交换剂：取决于被分离物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电荷则选用阳离子交换剂；如带负电荷则选用阴离子交换剂。 　选择离子交换剂基质：聚苯乙烯等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质。纤维素、葡聚糖、琼脂糖等交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。 ; （２）离子交换剂的预处理、再生和保存; 2）再生 使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以借助转型处理完成。 所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。 3)保存 一般加入0.02%的叠氮钠，4℃保存。; （３）层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1：10～1：50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。; （４）平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。 一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。 ;（５）上样 离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%-5%(体积分数)为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。 用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。;（６）洗脱 在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有